タンパク質-リガンド相互作用をモニタリングするための定量的細胞内水素NMR分光法

天然の細胞環境における標的タンパク質と低分子テストリガンドとの相互作用を監視するには、ベースにゲルプラグを含むバッファーを充填したNMRチューブから始めます。アガロースに包埋された標的タンパク質発現細胞をNMRチューブに注入し、糸状構造を形成します。

チューブをバイオリアクターのフローユニットにロードし、細胞の生存率を維持するための増殖培地を供給します。フローユニットを核磁気共鳴装置またはNMR装置内に挿入します。

強い磁場の下では、タンパク質の水素原子の原子核が磁化され、磁場と平行に整列し、低エネルギー状態に適応します。

高周波パルスを印加すると、原子核が磁場に対して逆平行に整列し、より高いエネルギー状態に遷移します。

短いパルスの後、核は元の位置に戻り、吸収されたエネルギーを放出します。検出器はこのエネルギーを捕捉し、水素原子の共鳴周波数を表す NMR スペクトルを生成します。各スペクトルピークは、特定の電子環境における異なる水素原子に対応します。

リガンド分子をフローユニットに追加します。これらは細胞内に浸透し、標的タンパク質と相互作用し、水素原子の周囲の電子環境を変化させ、共鳴周波数の変化を引き起こします。

NMRスペクトルを比較します。リガンド結合後のスペクトルの違いは、タンパク質とリガンドの相互作用が成功していることを示しています。

パスツールピペットを使用して、フローユニットNMRチューブの底に60〜70マイクロリットルの1.5%アガロースゲルを満たし、氷の上に置いて高さ5mmの底プラグを作成します。細胞ペレットをブロックヒーターで15〜20秒間加熱し、気泡の形成を避けて、細胞を450マイクロリットルのアガロース溶液に慎重に再懸濁します。

細胞アガロース懸濁液を、1ミリリットルのシリンジに接続された内径0.75ミリメートルの長さ30センチメートルのクロマトグラフィーPEEKチューブに吸引します。チューブを室温で2分間冷まします。フローユニットNMRチューブに室温で100マイクロリットルのPBSを事前に充填します。シリンジをそっと押して、アガロースに埋め込まれた細胞の糸をフローユニットNMRチューブにキャストします。

空のNMRチューブをフローユニットから取り外し、流量を毎分2ミリリットルに数分間増やして、インレットチューブ内の残留気泡を除去します。流量を毎分0.2ミリリットルに設定し、細胞の入ったNMRチューブをゆっくりと、しかし安定して上に押し上げて挿入します。バイオリアクター培地を毎分0.1ミリリットルの流量で供給します。

NMR分光計の温度を310ケルビンに設定し、フローユニットを分光器に挿入します。バイオリアクターをNMR分光計に挿入したら、培地交換が行われるまで数分待ちます。陽子チャネルのマッチングとチューニングを調整し、磁石をシムし