タンパク質オリゴマーのためのマルチアングル光散乱を用いたサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

タンパク質オリゴマーは、より大きな機能単位を形成するために結合する複数のタンパク質サブユニットの複合体です。

SEC-MALSによって溶液中のタンパク質モノマーとそのオリゴマーの分子量を決定するには、サイズ排除クロマトグラフィーとマルチアングル光散乱の組み合わせを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムから始めます。

カラムには、より小さなサイズの分子をその中に捕捉する多孔質のふるい状の球状ゲルビーズが含まれています。タンパク質の天然状態と互換性のあるバッファーでカラムを平衡化します。

タンパク質モノマーとオリゴマーを含むサンプルをカラムの上部にロードします。

流れの間、オリゴマーはカラムの粒子間空間を通過しますが、モノマーはビーズの細孔内に閉じ込められます。これにより、より大きなサイズのタンパク質オリゴマーは、より小さなサイズのモノマーよりも速く移動します。

溶出の速いオリゴマーを、次に溶出の遅いモノマーをMALS検出器に向けます。

検出器を通過すると、レーザー光がそれらを照らし、さまざまな角度で散乱されます。マルチサブユニットオリゴマーは、モノマーよりも多くの光を散乱します。

複数の角度での散乱光の強度は、タンパク質オリゴマーとモノマーの分子量に正比例します。

この手順は、テキストプロトコルで説明されているように、SEC-MALSシステムの準備から始めます。HPLCグレードの試薬を使用して、50〜100ミリリットルの塩化ナトリウムを含む1リットルのリン酸緩衝生理食塩水を調製します。ボトルトップポリエーテルスルホンフィルターなどを使用して、バッファーを0.1ミクロンまでろ過します。

最初の50〜100ミリリットルのバッファーを廃液ボトルにろ過して、ドライフィルターから微粒子を除去します。次に、残りをろ過して、ろ過された脱イオン水で事前に洗浄し、ほこりが入らないように保管した清潔な滅菌ボトルにろ過します。

毎分0.5ミリリットルの流速でカラムを一晩洗い流し、バッファー内のカラムを平衡化し、微粒子を除去します。FPLCの「連続フロー」モードを使用し、すべてのSEC-MALS実行が完了するまでフローが停止しないようにします。一晩のフラッシュ中に dRI フローセルをパージモードにします。

フラッシュを開始するときは、カラム内の圧力の急激な変化によって引き起こされる「カラム脱落」効果を防ぐために、流量を徐々に上げてください。サンプル実行を開始する前に、パージをオフにします。

カラムの下流のチューブを軽くたたいて、蓄積した粒子を放出して、システムの清浄度を確認します。MALS装置のフロントパネルディスプレイにある90度検出器の信号を観察します。ピークツーピークノイズが50〜100マイクロボルト以下であることを確認します。また、屈折率またはRI信号が1 x ^10-7屈折率単位未満で安定していることを確認します。

「ブランク」注入を実行して、インジェクターに粒子がないことを確認します。「ブランク」とは、新鮮な滅菌バイアルで調製されたランニングバッファーのことです。粒子ピークの体積が1ミリリットル以下で、ベースラインより5ミリボルト以下の場合、システムはサンプルの準備ができています。それ以外の場合は、きれいになるまで追加のブランク注入を実行するか、メンテナンスを実行してインジェクターを洗浄します。

次に、SECバッファー中に1〜2ミリリグラム/ミリリットルで少なくとも200マイクロリットルのBSAを調製します。シリンジチップフィルターを使用してタンパク質を0.025ミクロンまでろ過します。乾いたフィルターから粒子を除去するために、濾液の最初の数滴を廃棄します。または、サンプルを10,000倍gで15分間遠心分離して、不溶性凝集体やその他の大きな粒子を沈殿させます。次に、100マイクロリットルのBSA溶液をループに注入します。