相互作用する2つのタンパク質を単離するための二分子相補的アフィニティー精製

二分子相補性アフィニティー精製を使用して特定の相互作用タンパク質のペアを検出および単離するには、哺乳類細胞を含む培養プレートに二分子蛍光相補プラスミド-トランスフェクション剤混合物のペアを追加します。

1つのプラスミドは、レポーター蛍光タンパク質フラグメントに融合した1つの相互作用タンパク質(ベイトタンパク質)をコードします。もう一方のプラスミドは、蛍光タンパク質の相補的なフラグメントに融合した他の結合タンパク質(獲物タンパク質)をコードします。

インキュベート。トランスフェクション剤はプラスミド細胞の取り込みを促進します。トランスフェクトに成功した細胞は、細胞膜に局在したタンパク質を発現します。

餌と獲物のタンパク質の相互作用により、蛍光タンパク質フラグメントが近づきます。これにより、フラグメントが融合して再折りたたまれ、機能的な蛍光タンパク質が形成され、その蛍光は蛍光顕微鏡で視覚化できます。

培地を非イオン性界面活性剤を含む溶解バッファーに置き換えて細胞膜を破壊し、融合タンパク質を放出します。細胞溶解物をチューブに集めます。遠心機。

融合タンパク質含有上清を新鮮なチューブに移します。蛍光タンパク質を標的とするシングルドメイン抗体であるナノボディと結合したアガロースビーズを添加し、折りたたまれた蛍光タンパク質上の3次元エピトープを認識して結合します。

遠心機。融合タンパク質結合アガロースビーズをバッファーに再懸濁します。加熱してアガロースビーズから融合タンパク質を解離させます。SDS-PAGEを実行して個々のタンパク質を分離し、蛍光タンパク質フラグメントに特異的な抗体でウェスタンブロッティングを行います。

蛍光フラグメントでタグ付けされた相互作用タンパク質のみが検出され、それらの単離が確認されます。

まず、10ミリリットルのDMEMを含む10センチメートルの皿に細胞HEK293Tを播種します。次に、各二分子蛍光相補ベクターを2.5マイクログラムを500マイクロリットルのトランスフェクションバッファーで希釈します。

10マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加え、混合物を10秒間ボルテックスします。次に、サンプルを短時間遠心分離し、室温で10分間インキュベートします。次に、DNAトランスフェクション混合物を皿に滴下的に加えます。次に、サンプルを8〜24時間インキュベートします。

テキストプロトコルに概説されているように、細胞溶解バッファーと補充された細胞溶解バッファーを調製します。次に、氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。PBSを吸引し、1ミリリットルの氷冷添加細胞溶解バッファーを加えます。

次に、皿を氷の上に置き、5分間インキュベートします。次に、細胞スクレーパーを使用して細胞を除去し、冷却した微量遠心チューブに移します。チューブを重力18,000倍で摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞破片を除去します。次に、透明な上清を新しい微量遠心チューブに移します。

適切な量のアガロースビーズを1ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、ビーズを300倍の重力で遠心分離し、上清を慎重に除去します。次に、各サンプルに20マイクロリットルのアガロースビーズを加え、摂氏4度でエンドツーエンドの回転で2時間インキュベートします。

ビーズを300倍の重力で遠心分離し、細胞溶解バッファーで3回洗浄します。次に、洗浄したビーズを50マイクロリットルの希釈サンプルバッファーに再懸濁します。最後に、サンプルを摂氏95度で2〜3分間加熱します。