受容体-リガンド相互作用を破壊する化合物を同定するための競合的結合アッセイ

競合結合アッセイは、標的受容体に競合的に結合し、天然のリガンド結合を阻害することにより、受容体とリガンドの相互作用を阻害する小分子を同定します。

受容体特異的小分子拮抗薬の存在下で受容体とその天然リガンドとの相互作用を特定するには、標的受容体を発現するヒトTリンパ球細胞の懸濁液から始めます。

細胞懸濁液を、アンタゴニスト濃度の増加を含むマルチウェルプレートのウェルに加えます。インキュベート。アンタゴニストは、受容体の天然リガンド結合部位であるオルソステリック結合部位に結合します。

一定濃度の蛍光標識天然リガンドをウェルに加えます。インキュベート。

低濃度では、アンタゴニストはオルソステリック結合部位をほとんど占めず、受容体への自然なリガンド結合を可能にします。しかしながら、高濃度では、アンタゴニストはオルソステリック結合部位のほとんどを占め、天然のリガンド受容体結合を最小限に抑えることができます。

遠心分離機で細胞をペレット化します。上清を捨てます。細胞をパラホルムアルデヒドに再懸濁して固定し、細胞の形態を維持します。

フローサイトメーターを使用して、アンタゴニストおよび蛍光リガンド結合受容体を発現する個々のTリンパ球からの蛍光シグナルを分析します。

受容体特異的アンタゴニスト濃度の増加に伴う平均蛍光強度の用量依存的な減少は、アンタゴニストがオルソステリック受容体結合部位に競合的に結合し、自然なリガンド-受容体相互作用を阻害していることを示しています。

まず、事前定義された実験レイアウトに従って、100マイクロリットルの化合物溶液を透明な96ウェルの丸底プレートに分注します。

マルチチャンネルピペットを使用して、試薬リザーバーから50マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルプレートに加えます。プレートを室温で暗所で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、同様の試薬リザーバーから50マイクロリットルの蛍光標識100ナノグラム/ミリリットルCXCL12を96ウェルプレートのウェルに加えます。暗所で室温で30分間インキュベートします。

次に、96ウェルプレートを400倍の重力で室温で5分間遠心分離します。プレートを裏返して、ペレット化された細胞から上清を取り除きます。プレートをティッシュで乾かします。マルチチャンネルピペットを使用して、試薬リザーバーから200マイクロリットルの新鮮なアッセイバッファーをウェルに加えます。

すぐにプレートを室温で重力400倍で5分間遠心分離します。もう一度、プレートをひっくり返して上清を取り除き、ティッシュの上で乾燥させます。最後に、PBSに溶解した200マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒドに細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。この手順により、セルが修正されます。

フローサイトメトリーでサンプルを分析するには、デバイスを起動し、対応するソフトウェアを開きます。ドットブロット形式で視覚化する細胞パラメータを、前方散乱領域、側面散乱領域、およびヒストグラムビューでは蛍光色素検出チャネルとして選択します。

つのサンプル(たとえば、陰性対照サンプル)を選択して、前方散乱および側方散乱パラメーターに基づいて定義された均質な細胞集団のゲーティングを実行します。フローサイトメトリーデバイスにセルをロードするための設定

注入前に3つの混合物を選択します。100マイクロリットルの固定細胞の自動注入を選択し、毎秒1.5マイクロリットルのサンプル流量を使用します。「データの取得」を選択してサンプルを実行します。このサンプルの前方散乱および側方散乱パラメータ、および蛍光色素検出が画面に表示されます。

次に、ソフトウェアのゲーティング ツールを選択します。前方散乱および側方散乱ドットブロットプロットの視覚化に基づいて、ゲーティングによって均質で生存可能な細胞集団を事前に定義します。サンプルごとに 20,000 の「イベント」を分析する場合に選択します。

これは、サンプルごとに、事前定義されたゲート内にある20,000個の細胞が最終的に分析されることを意味します。データ取得は、このイベント数に達するまで継続されます。

するウェルを最初に選択して実行を開始します。次に、「ウェルズの実行」を選択します。

フローサイトメトリーデバイスは、事前定義されたゲート内にある20,000個の細胞からの平均蛍光シグナルに対応する各サンプルの平均蛍光強度を記録することにより、これらのサンプルを1つずつ分析します。

最後に、プロトコルに記載されているようにデータ分析を実行します。