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受容体とリガンドの相互作用を研究するには、表面にテストリガンドを発現する標的細胞を含む培地を含むマルチウェルプレートから始めます。
膜結合キメラ受容体を発現する新規のB細胞集団である操作マウスBW細胞を追加します。キメラ受容体は、B細胞受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに融合した特定の受容体の細胞外ドメインを含む。
標的細胞上のリガンドは、BW細胞のキメラ受容体の細胞外ドメインと相互作用し、BW細胞で細胞内シグナル伝達ドメインの活性化を引き起こします。これにより、下流のシグナル伝達とサイトカイン(BW細胞の外に放出され、培地に現れる分泌レポーター分子)の産生が引き起こされます。
プレートを遠心分離します。サイトカイン含有上清を、抗サイトカイン抗体で事前にコーティングされたELISAプレートに移します。サイトカインは抗体のFab領域と相互作用し、プレート表面に固定化されます。
プレートをブロッキング溶液で処理して、非特異的結合部位をブロックします。事前に結合したサイトカインと相互作用して免疫複合体を形成するビオチン化抗サイトカイン抗体を追加します。
酵素結合ストレプトアビジン溶液でプレートを重ねます。ストレプトアビジンは免疫複合体のビオチンと結合します。
プレートを基板で処理します。酵素と基質の相互作用により、着色された生成物が生成され、溶液に同じ色が与えられます。着色された溶液はレポーター分子の存在を確認し、受容体とリガンドの相互作用が成功したことを示しています。
50,000個のトランスフェクトされたBW細胞を目的のターゲットとともに、96ウェルプレートの1つのウェルに使用します。プレートを48時間インキュベートします。次に、プレートを摂氏-20度で凍結します。
ELISAプレートを抗マウスIL-2抗体でコーティングします。0.05%マイクログラムの抗マウス-IL-2を50マイクロリットルのPBSの容量で各ウェルに入れます。コーティングされたプレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。
摂氏37度で短いインキュベーション期間を使用して、以前にターゲットとインキュベートした凍結BW細胞を解凍します。次に、プレートを遠心分離し、各ウェルから100マイクロリットルの上清をプレコートされたELISAプレートに移し、摂氏37度で2時間インキュベートします。
この後、ビオチン抗マウス-IL-2をELISAプレートに加えます。次に、インキュベーションおよび洗浄後、HRP結合ストレプトアビジンをプレートに加えます。インキュベーションおよび洗浄後、100マイクロリットルのTMB基質溶液をELISAプレートの各ウェルに加えます。最後に、650ナノメートルでELISAプレートを読み取ります。