受容体-リガンド相互作用を定量するための生体膜力プローブ

抗原提示細胞APC上のT細胞受容体TCRとMHC(主要組織適合性複合体)によって提示される抗原ペプチドとの相互作用により、T細胞はAPCに機械的な力を加えます。この現象は、T細胞の活性化に必要です。

生体膜フォースプローブであるBFPを使用して受容体とリガンドの相互作用を定量化するには、スライドベースのカスタムセルチャンバーから始めます。セルチャンバーを顕微鏡下に置きます。

ビオチン化した腫れた赤血球の懸濁液、ペプチド結合MHC-ストレプトアビジン-ビオチン複合体でコーティングされたプローブガラスビーズ、およびT細胞をチャンバーに注入します。プローブ、ターゲット、およびヘルパーバッファー充填マイクロピペットをチャンバーの周囲に配置します。

プローブピペットでビオチン化赤血球を吸引し、空白領域に配置します。ターゲットマイクロピペットでT細胞を吸引し、RBCの右側に配置します。ヘルパーマイクロピペットでプローブビーズを吸引し、赤血球の頂点に取り付けます。ビーズのストレプトアビジンは赤血球のビオチンに結合し、フォースプローブを形成します。

T細胞をフォースプローブに合わせて、TCRがそのリガンド(MHC結合ペプチド)と相互作用し、T細胞が赤血球に力を加えるようにします。T細胞を引っ込めてTCR-ペプチド結合を切断し、赤血球を変形させ、ビーズを置換します。

結合を切断するために必要な力を測定する — 結合が強いほど、より大きな力と切断により多くの時間が必要であり、寿命が長いことを示します。

BFP実験を開始するには、顕微鏡と光源の電源を入れます。チャンバーをメイン顕微鏡ステージに置きます。次のステップは、BFPの3つのマイクロピペットすべてを取り付けることです。左側のプローブは赤血球をつかむことです。右のターゲットはセルをつかむことであり、右下のヘルパーはビーズをつかむ役割をする。

取り付けるには、マイクロインジェクターを使用して、マイクロピペットに実験用バッファーを埋め戻します。マイクロピペットをピペットホルダーから外し、先端から液体が滴り落ちるように低い場所に保持します。マイクロピペットをホルダーの先端にすばやく挿入し、挿入中にマイクロピペットに空気のマイクロバブルが入らないようにします。

ホルダーネジを締めてから、各ピペットホルダーを対応するマイクロマニピュレーターに取り付けます。マイクロピペットをチャンバーに向かって押して、先端がチャンバーバッファー領域に入るようにします。マイクロピペットの位置を調整し、顕微鏡の視野の下で見つけます。

チャンバーホルダーのステージを移動して、3つの要素のコロニーを1つずつ見つけます。マニピュレーターのノブを回して、マイクロピペットの先端を1つのセルまたはビーズに近づけて、対応するマイクロピペットの位置を調整します。対応するマイクロピペット内の圧力を調整して、細胞またはビーズを吸引します。3つのマイクロピペットはすべて、対応する要素をキャプチャします。

チャンバーホルダーステージの周りを移動して、実験が行われる注入された要素のコロニーから離れたオープンスペースを見つけます。

顕微鏡のビジュアルモードを切り替えて、コンピュータープログラムで画像を視覚化します。ピペットチップの3つの要素すべてをプログラムの視野に移動します。次に、プローブビーズと赤血球を位置合わせし、プローブビーズを赤血球の頂点に慎重に操作します。次に、ビーズをRBCに短時間叩きつけ、ゆっくりと引っ込めます。

ヘルパーマイクロピペットの圧力を調整してビーズをそっと吹き飛ばし、赤血球の頂点に接着したままにします。ヘルパーマイクロピペットを離し、ターゲットとプローブビーズを位置合わせします。

プログラムの[視野]ウィンドウで、プログラムツールを使用して、プローブマイクロピペット、赤血球、および赤血球とプローブビーズの間の円形接触面積のそれぞれの半径を測定します。これらの値により、テキストプロトコルにリストされている方程式によって赤血球のばね定数を推定できます。

目的の赤血球スプリング定数をプログラムに入力した後、赤血球の頂点を横切って水平線を引くと、この線に沿った各ピクセルの明るさを示す曲線が隣接するウィンドウに生成されます。しきい値線をドラッグして、カーブの深さの約半分になります。

次に、目的の実験モードを選択します。必要に応じてパラメータを設定します。[開始]をクリックすると、プログラムがターゲットピペットを移動し、ターゲットをプローブに接触させたり

データ収集は並行して実行され、プローブビードの位置をリアルタイムで記録します。ボタンをクリックしてプログラムを停止します 実験の停止 取得したデータを保存できるウィンドウがポップアップします。