競合するGTPase結合タンパク質パートナーを研究するための競合結合アッセイ

グアニンヌクレオチド結合タンパク質(GTPアーゼのカテゴリー)は、分子スイッチとして機能し、GTP結合活性型とGDP結合非活性型の間で循環します。

活性GTPアーゼは、特定のタンパク質パートナーに結合します。これらのパートナーは、GTPase上の同じ結合部位をめぐって競合します。

競合結合を研究するには、磁気ビーズに固定化されたGTP結合GTPアーゼの懸濁液を採取することから始めます。最初の相互作用パートナーである蛍光タグ付きプロテインAを追加します。攪拌下でインキュベートして、ビーズを懸濁状態に保ちます。プロテインAは、すべてのGTPアーゼ分子の結合部位に結合し、飽和させます。

この溶液を複数のチューブに均等に分割します。2番目の相互作用パートナーである蛍光タグ付きプロテインBをチューブに増やして追加します。攪拌下でインキュベートします。

プロテインBはGTPアーゼ上の同じ結合部位に結合し、プロテインAを競合的に置換します。

チューブを磁場にさらして、片側のビーズを集めます。上清を廃棄して、結合していないタンパク質を除去します。タンパク質複合体ビーズを適切なバッファーに再懸濁し、結合したタンパク質を定量します。

プロテインBの各濃度でGTPアーゼに結合したプロテインAとBの相対強度をプロットします。

プロテインBは、プロテインAよりも比較的低い濃度で平衡に達し、GTPアーゼ分子の半分の結合部位を占め、GTPアーゼに対するプロテインBの親和性が高いことを示しています。

競合結合を実行するには、それぞれ200マイクロリットルの競合結合バッファーを含む6本のマイクロフュージチューブをセットアップします。各チューブには、10マイクロリットルのヌクレオチドロードRac1ビーズと、5マイクロリットルのRac1結合タンパク質Aが一定結合タンパク質として含まれている必要があります。

各チューブに、可変結合タンパク質として0、1、2.5、5、10、または20マイクロリットルのRac1結合タンパク質Bを追加します。これらの容量は、一定および可変結合タンパク質のストック濃度がほぼ等しいことを前提としており、調整が必要な場合があります。

競合結合バッファーを添加することにより、結合混合物の総体積を235マイクロリットルに構成します。次に、200マイクロリットルの競合バッファー、10マイクロリットルの実験用ヌクレオチドロードRac1ビーズ、および10マイクロリットルのRac1結合タンパク質Aを含むマイクロフュージチューブをセットアップします。

次に、テキストプロトコルに記載されているように、GDP、GTPγS、およびヌクレオチドコントロールチューブをセットアップします。チューブを2時間インキュベートし、摂氏4度で反転して混合します。インキュベーション後、ビーズを競合結合バッファーで3回洗浄します。

最後に、結合タンパク質を20マイクロリットルの還元サンプルバッファーで溶出します。