標的化学物質の効果を研究するための肥満細胞脱顆粒アッセイ

肥満細胞 — 特殊な白血球には、ベータヘキソサミニダーゼなどのリソソーム酵素が豊富な分泌顆粒が含まれています。

肥満細胞の脱顆粒(分泌顆粒の放出を伴うプロセス)を実行するには、免疫グロブリンで前処理されたマウス腹膜肥満細胞懸濁液を含むマルチウェルプレートから始めます。

細胞を標的化学物質で処理します。刺激電位を持つ標的化学物質は、肥満細胞の特異的受容体上の事前に結合した免疫グロブリンと相互作用します。これにより、ベータヘキソサミニダーゼを含む顆粒の細胞表面への移動が活性化され、溶液中に放出されます。

プレートを遠心分離して細胞をペレット化し、酵素含有上清を新鮮なプレートの空のウェルに移します。細胞ペレットを溶解バッファーで処理して細胞を溶解し、その内容物を細胞内ベータヘキソサミニダーゼを含む溶解物に放出します。

酵素含有ライセートを同じマルチウェルプレートの別のウェルに加えます。酵素の基質であるp-ニトロフェニル-アセチル-D-グルコサミンで両方のウェルを処理し、インキュベートします。酵素は基質を加水分解し、溶液を黄色にする着色生成物であるp-ニトロフェノールを放出します。

ウェルにアルカリ性停止溶液を重ねて反応を終了し、p-ニトロフェノールをp-ニトロフェノール酸に変換して黄色の着色を強めます。分光光度法により、405ナノメートルで両方のウェルの溶液の吸光度を推定します。

肥満細胞の脱顆粒に対する標的化学物質の刺激効果と相関する酵素の放出率を計算します。

ベータヘキソサミニダーゼの放出を測定するには、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルVボトムウェルプレートに移します。各ウェルに25マイクロリットルの刺激溶液または対照溶液を追加します。次に、細胞を摂氏37度で45分間インキュベートします。その後、96ウェルプレートを氷の上に5分間置いて反応を停止します。次に、プレートを摂氏4度で120gで4分間遠心分離します。

120マイクロリットルの上清を平底の96ウェルプレートに移し、氷の上に置きます。細胞ペレットに触れないように注意しますが、上清を完全に吸引します。次に、125マイクロリットルの溶解バッファーを細胞ペレットに加えます。細胞ペレットを室温で5分間インキュベートし、インキュベーション後にピペッティングを繰り返して再懸濁します。

25マイクロリットルの4ミリモルpNAG溶液を、新しい平底96ウェルプレートの必要なウェルにピペットで入れます。調製したpNAG溶液に、各上清25マイクロリットル、および各細胞ライセート25マイクロリットルを個別に加えます。反応バッチを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、150マイクロリットルの停止液を各ウェルにピペットで投与して反応を停止します。

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