マウスクッパー細胞の単離と培養

クッパー細胞は、肝臓の正弦波に局在する常在マクロファージで、肝臓を感染症から保護するのに役立ちます。

マウスクッパー細胞を単離するには、採取したばかりの灌流マウス肝臓を培地含有皿に収めます。コラゲナーゼによる肝灌流ステップは細胞外マトリックスを消化し、肝細胞の解離を引き起こします。

肝被膜を破裂させて、実質細胞、PC、非実質細胞、クッパー細胞、内皮細胞、星状細胞、および残りの赤血球を含むNPCを含む解離した肝細胞を放出します。

フィルター

で破片を取り除きます。濾液に対して低速分画遠心分離を実行して、PCを選択的に沈殿させます。NPC含有上清を収集します。遠心分離して細胞を濃縮します。

細胞を培地に再懸濁し、密度の異なる2つの勾配培地層で不連続な等張密度勾配上に層状に層状にします。遠心分離では、細胞は勾配培地に対する密度に基づいて分離されます。

勾

配層の界面で濃縮されたNPC層を収集します。培地を含むチューブと遠心分離機に移します。再懸濁したNPCをマルチウェルプレートに播種します。

数分以内に、懸濁中のクッパー細胞はプラスチックウェル表面に容易に付着しますが、他のNPCは培地に残ります。クッパー細胞の増殖をサポートするために、培地を新鮮な培地と交換します。

クッパー細胞を精製するには、15ミリリットルのクッパー細胞単離培地を入れたペトリ皿に灌流肝臓1つを入れます。はさみまたはピンセットで、グリッソンカプセルを破裂させ、すべての肝細胞を培地に放出します。溶液を100マイクロメートルのセルストレーナーを通して遠心分離管にろ過します。次に、細胞懸濁液を摂氏4度で50gで2分間遠心分離します。

実質細胞はペレット内にあり、非実質細胞は上清内にあります。上清を清潔な遠心分離管に集め、50 gで2分間遠心分離します。合計4回の転送とスピンを繰り返します。

次に、上清を1,350 gで15分間遠心分離して、非実質細胞をペレット化します。上清を廃棄し、ペレットを10ミリリットルのクッパー細胞分離培地に再懸濁します。テキストプロトコルに従って事前に調製した不連続な25/50%等張勾配に非実質細胞溶液を加え、850gで加速または破損せずに15分間遠心分離します。

10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、25/50%SIP界面に近い25%SIP画分内で濁っているように見える濃縮クッパー画分を約12ミリリットル吸引します。細胞を35〜40ミリリットルのクッパー細胞分離培地を含む遠心分離管に移し、穏やかに混合します。次に、1,350 g、摂氏4度で遠心分離して細胞をペレット化します。

上清を捨て、5〜10ミリリットルの予熱培地を使用して細胞を再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、トリパンブルー染色を使用して生存率を測定します。精製された非実質細胞を24ウェルプレー