ヒト誘導多能性幹細胞のマクロファージへの分化

成体体細胞は、幹細胞のような未分化および増殖状態を示す人工多能性幹細胞(iPSC)を得るために遺伝的に再プログラムすることができます。

ヒトiPS細胞をマクロファージ(病原体や細胞破片を食作用する白血球)に分化させるには、非細胞接着表面を持つ培養プレートから始めます。

成長因子、骨形成タンパク質、幹細胞因子、血管内皮増殖因子を含む培地を追加します。iPS細胞を播種し、インキュベートします。

非

粘着性の表面は、iPS細胞の付着を防ぎ、細胞を懸濁状態に維持し、3次元胚様体(EB)への凝集を促進します。成長因子は、EB内で中胚葉系統細胞へのiPS細胞分化を開始します。

分化したEBを遠心分離管に移します。重力によって落ち着くようにします。インターロイキン-3、IL3、およびマクロファージコロニー刺激因子CSF1を含む新鮮な培地にEBを再懸濁します。ゼラチンでコーティングされた細胞培養プレートにEBをプレーティングします。

ゼラチン(細胞外マトリックスタンパク質)は、EBの付着を促進します。IL3はEBを刺激して造血幹細胞前駆細胞に分化し、骨髄細胞を生じさせます。CSF1は、骨髄細胞の増殖と、放出されて培地中に懸濁したままのマクロファージ前駆体への分化をサポートします。

浮遊細胞を回収し、遠心分離します。CSF1を添加した培地に細胞を再懸濁します。

コーティングされていない培養プレートに細胞をプレーティングします。

CSF1は、マクロファージ前駆体の終末分化を誘導し、完全に機能する接着性のある成熟マクロファージに

誘導します。

0日目に分化プロセスを開始するには、2.25ミリリットルのステージ1培地を超低付着6ウェルプレートの2つのウェルに加えます。次に、6ウェルプレート内のiPS細胞の180%コンフルエントウェルの場合、メンテナンス培地を1.5ミリリットルのステージ1培地に交換します。新しい細胞継代ツールを使用してコロニーを切断します。ピペットを使用して、切断したコロニーを超低付着6ウェルプレートの2つのウェルに移します。

2日目に、2日目の胚様体を含む6ウェルウェルプレートに0.5ミリリットルのhESC-SFM培地を加えてサイトカイン濃度を調整します。

4日目に、6ウェル組織培養プレートの4つのウェルを0.1%ゼラチンでコーティングします。少なくとも10分間インキュベートした後、ゼラチンを取り除き、2.5ミリリットルのステージ2培地を加えます。

6ウェルプレートの2つのウェルから形成された胚様体を収集し、それらを50ミリリットルの遠心分離管に入れます。重力によってチューブの底に落ち着くようにします。次に、チューブから培地を慎重に吸引し、胚様体を2ミリリットルのステージ2培地に再懸濁します。

10〜15個の胚様体を、2.5ミリリットルのステージ2培地を含むゼラチンコ