機械的解離を用いたマウス背側根神経節からのマクロファージの単離

後根神経節(DRG)は、脊髄に沿った神経細胞体のクラスターであり、末梢神経系から中枢神経系に感覚情報を運びます。末梢神経損傷は、DRG にマクロファージが蓄積し、神経因性疼痛を発症します。

酵素を含まない方法を使用して生存マクロファージを単離するには、細胞ストレスを制限するために、氷冷バッファーで満たされたホモジナイザーに新たに解剖されたマウスDRG組織を取り出します。乳棒を使用して、組織を機械的に均質化して細胞を放出します。

細胞ストレーナーでろ過して細胞の塊を除去し、フロースルー中の単一細胞懸濁液を得る。組織ホモジネートには、マクロファージとフリーフローティングミエリン(ニューロンの絶縁鞘)を含むニューロンと非ニューロン細胞が含まれています。

ろ過したホモジネートを密度勾配媒体を含むチューブに入れ、遠心分離します。遠心力下で、浮力密度の高い生細胞がチューブの底に沈殿してペレットを形成しますが、ミエリンは浮遊したままになります。上清を捨てます。

マクロファージ特異的細胞表面受容体に対する蛍光色素結合抗体を含むバッファーに細胞を再懸濁します。必要な期間インキュベートします。抗体はマクロファージ細胞上の受容体に結合し、細胞表面を蛍光標識します。結合していない抗体を洗浄して除去します。

フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。抗体特異的蛍光シグナルは、サンプル中のマクロファージの存在を示します。

実験を開始する前に、9 容量の培地と 1 容量のカルシウムおよびマグネシウムを含まない 10X HBSS を混合して密度勾配培地の作業溶液を調製し、氷上に保管します。マウスが後足のつまみに対する反応の欠如によって完全に麻酔されていることを確認します。

、麻酔をかけたマウスを仰臥位で化学ヒュームフード内に置き、4本の足をテープで固定します。鉗子を使用して胸郭の下の皮膚を持ち上げ、手術用ハサミで小さな切開をして肝臓と横隔膜を露出させます。同じはさみを使用して、横隔膜と胸郭を切断し、胸膜腔を開いて鼓動する心臓を露出させます。

次に、虹彩はさみで右心耳を素早く切ります。出血が認められたら、左心室の後端に30ゲージの針を挿入し、10ミリリットルの予冷した1X PBSをゆっくりと注入して動物を灌流します。

背側椎弓切除術を行うには、マウスを腹臥位に置きます。サイズ11のメスを使用して、胸部から仙骨領域まで縦方向の横方向の深い切開を2回行います。次に、背筋層を露出させた皮膚を取り除きます。次に、フリードマン・ピアソン・ロンジャーを使用して、腰仙椎突起と両側横突起が露出するまで結合組織と筋肉を剥がします。

まず、フリードマン・ピアソン・ロンジャーを使用して、脊柱後側を慎重に開きます。次に、フリードマン・ピアソン・ロンジャーとノイエス・スプリング・ハサミを切り替えて椎骨を除去し、無傷の脊髄神経が付着した脊髄を露出させます。同側および対側の腰椎 DRG を注意深く解剖します。

それを1ミリリットルの氷冷カルシウムとマグネシウムを含まない1X HBSSにDounce組織ホモジナイザーに入れます。Dounceホモジナイザー内のDRG組織を緩い乳棒で20〜25回均質化します。滅菌70マイクロメートルナイロンセルストレーナーを滅菌50ミリリットルのコニカルチューブに入れます。800マイクロリットルの氷冷1X HBSSを使用して、セルストレーナーを濡らします。

ピペットを使用して、ホモジナイザーから湿式細胞ストレーナーに均質化された組織懸濁液を回収し、50ミリリットルのコニカルチューブに回収します。ホモジナイザーを800マイクロリットルの氷冷1X HBSSで2回すすぎ、液体を同じ50ミリリットルの円錐形チューブに集めて収率を高めます。

1.5ミリリットルの平衡化した氷冷等張密度勾配培地を滅菌5ミリリットルのポリスチレンFACSチューブに加えます。細胞ホモジネートを50ミリリットルのコニカルチューブからこのFACSチューブに移し、ピペットを上下に移してよく混合します。

500マイクロリットルの1X HBSSを追加して、上部を密閉します。細胞を摂氏4度で20分間、800倍gで遠心分離します。チューブの底にある細胞ペレットを乱すことなく、培地中のミエリンを含む上清を慎重に吸引します。

5%ウシ胎児血清を含む100マイクロリットルのPBSをペレットに加え、DRG細胞を再懸濁します。次に、α-マウスCX3CR1-APC抗体を細胞に添加し、摂氏4度の暗所で1時間インキュベートします。

5ミリリットルのPBSで細胞を一度洗浄します。細胞を摂氏4度で8分間、360回gで遠心分離します。上清を吸引し、FACS分析のために細胞ペレットを300マイクロリットルのPBSに再懸濁します。