一般的なリンパ系前駆細胞からの形質細胞様樹状細胞のin vitro作製

形質細胞様樹状細胞 (pDC) は、サイトカイン I 型インターフェロンを産生することによって感染に応答する免疫細胞です。

in vitroでpDCを生成するには、マウス骨髄から単離した一般的なリンパ系前駆細胞(CLP)の懸濁液を採取します。CLPはリンパ球と樹状細胞に分化することができます。

殖を阻害するためにガンマ線を照射したフィーダー細胞(付着間質細胞)の層の上に細胞懸濁液を加えます。フィーダー細胞は、CLPの分化に必要なサイトカインと細胞間接触を提供します。

適切な濃度のFms様チロシンキナーゼ3リガンド、またはFL(pDCの発生を促進する二価サイトカイン)を加えてインキュベートします。

CLPはフィーダー細胞間を移動し、増殖して、石畳の領域と呼ばれる細胞のグループを形成します。

培地中のFLは、CLP上のFlt3受容体(チロシンキナーゼ受容体)に結合します。結合は、受容体の二量体化と細胞質ドメイン上のチロシン残基の自己リン酸化を誘導します。

細胞質アダプタータンパク質はこれらの残基に結合してリン酸化され、シグナルを下流のシグナル伝達成分に伝達します。シグナル伝達カスケードは、CLPをpDC(懸濁液で成長する小さな丸い細胞)と、従来の樹状細胞(cDC)(より大きな紡錘形の接着細胞)に分化させます。

細胞を集めます。pDCおよびcDC特異的表面マーカーに対する抗体を追加します。フローサイトメトリーを使用して細胞を分析します。

pDC特異的マーカーが陽性で、cDC特異的マーカーが陰性の細胞は、pDCの発達が成功したことを示しています。

フローサイトメトリーによって一般的なリンパ系前駆細胞(CLP)を分析するには、次に、F_cが抗CD16/32で細胞を1〜2分間ブロックし、続いて適切な抗体カクテルで細胞を同時に染色します。

氷上で15分間後、細胞を3ミリリットルのFACSバッファーで洗浄し、ペレットを300マイクロリットルの新鮮なFACSバッファーに再懸濁します。次に、40マイクロメートルのストレーナーで細胞懸濁液をろ過し、適切なフィルターと電圧を使用してフローサイトメーターで細胞をすぐに選別し、目的の細胞を8ミリリットルの完全RPMIを含む15ミリリットルのチューブに収集します。

高濃度のpDC集団を生成するには、AC-6フィーダーシステムによるin vitro培養のために、採取された骨髄細胞からCLPの適切な集団を選別することが重要です。

ソートの最後に、細胞をスピンダウンし、CLP細胞ペレットを十分な完全なRPMIで再懸濁して、1ミリリットルあたり約5倍の10〜4番目の細胞の細胞密度を取得します。次に、AC-6フィーダー細胞を含む12ウェルプレートにウェルあたり500個の細胞を播種し、ミリリットルあたり100ナノグラムのFLT3リガンドを共培養物に補充します。次に、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートし、顕微鏡下で樹状細胞の定期的な視覚的モニタリング、またはDC発生を行います。

12日目に、共培養上清中の細胞を回収し、各ウェルを半ミリリットルの完全RPMI培地で1回洗浄し、得られた上清と洗浄液をプールします。次に、各ウェルに半ミリリットルの新鮮な培地を加え、細胞スクレーパーを使用して接着細胞を剥離します。分離した細胞を浮遊細胞と結合し、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを50マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁します。

次に、細胞をカウントし、先ほど示したように、_Fcブロッキング後のCD11c、CD11b、およびB220の発現について染色します。次に、共培養細胞は、従来のCD11c陽性、CD11b陽性、B220陰性、および形質細胞様CD11c陽性、CD11b陰性、B220陽性DC集団の存在について分析できます。