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免疫応答を誘発するために、樹状細胞 (DC) は、MHC クラス II と共刺激分子 CD80 および CD86 で示される抗原を示します。免疫応答特性に基づいて、それらは未熟なDC、成熟したDC、および寛容性DCに細分されます。
さまざまな樹状細胞サブセットをin vitroで生成するには、ヒト単球(成長因子とシグナル伝達分子であるサイトカインIL-4を含む完全培地中の免疫前駆細胞)を含むマルチウェルプレートから始めます。
細胞を長時間インキュベートします。成長因子とIL-4は、単球の増殖と未熟DCへの分化を誘導します。
未熟なDCはパターン認識受容体であるPRRを持ち、低MHCクラスIIおよび共刺激分子を発現し、免疫応答を誘発する能力の低下を示します。
未熟なDCを含む1つのウェルを免疫調節剤(ビタミンD3とグルココルチコイド)で処理します。これらの免疫調節剤は、MHC クラス II および共刺激分子の発現をダウンレギュレートします。これは、寛容性DC(誇張された免疫応答または望ましくない免疫応答を防ぐ免疫調節細胞)への分化につながります。
未熟なDCを含む別のウェルをリポ多糖類、LPS(抗原)で処理します。LPSは、細胞のトール様受容体-4(PRR)と相互作用し、シグナル伝達カスケードを開始し、成熟細胞に分化させます。これらの細胞は、抗原プロセシングと提示に効率的な、高いMHCクラスIIの共刺激分子、およびPRRを発現します。
樹状細胞サブタイプを表す明確な形態学的特徴について、差別処理されたウェルを観察します。
CD14+単球を0.3〜0.5 x 106の濃度で、IL-4の細胞培養培地1ミリリットルあたり6ウェルプレートに播種します。細胞を摂氏37度の組織培養インキュベーターで5%CO2でインキュベートします。4日目に、培養物から850マイクロリットルの培地を取り出し、遠心分離します。
上清を吸引し、ペレットを1ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁します。細胞混合物を培養物に戻します。5日目に、培地1ミリリットルあたり1マイクロリットルのビタミンD3ストックと1マイクロリットルのデキサメタゾンストックを2つのセットに加えて、忍容性moDCを生成します。
6日目に、GM-CSFの1ミリリットルあたり200ナノグラムとIL-4の1ミリリットルあたり200ナノグラムをすべてのセットに追加します。GM-CSFとIL-4のみで処理されたセットの1つにLPS1ミリリットルあたり1マイクログラムを加えて、成熟したmoDCを生成します。
1ミリリットルあたり1マイクログラムのLPSを1セットの寛容性モードmoDCに加えて、LPS耐性moDCを生成します。最後に、7日目に、培養皿をPBS-EDTAで洗い流して、さまざまな種類のmoDCを収穫します。