ELISpotアッセイを用いた抗体分泌B細胞の機能評価

抗体分泌 B 細胞 (ASC) は、病原体に対する保護を確保するために、IgG や IgM などの抗体アイソタイプを分泌する分化 B 細胞です。

in vitroでASCの機能評価を行うには、酵素結合免疫吸着スポットアッセイから始めます。ベースに活性化されたポリフッ化ビニリデン膜を含むELISpotプレートを取ります。

抗体のFc領域を含まないFab領域のみを含むポリクローナル抗体フラグメントとウェルをインキュベートします。各Fab領域には、特定の抗体アイソタイプ(IgGまたはIgM)の結合部位があり、両方のアイソタイプの同定が可能です。

インキュベーション中、抗体断片が膜に付着し、固定化につながります。

ウェルをブロッキング溶液でオーバーレイして、非特異的結合を防ぎます。活性化された抗体分泌B細胞をプレートに播種し、インキュベートします。ASCは、膜結合抗体フラグメントに結合するIgGやIgMなどのさまざまなアイソタイプを分泌します。

プレートをバッファーで洗浄し、結合していない分泌抗体を除去します。一部のウェルをIgMの酵素結合検出抗体で処理し、他のウェルをIgGの検出抗体で処理し、インキュベートします。

検出抗体はそれぞれのアイソタイプに結合し、免疫複合体を形成します。

酵素と相互作用して膜上に紫色の斑点を生成する比色基質をすべてのウェルに追加します。反応を停止するために停止液を追加します。

各ウェルで生成される色付きの斑点は、特定の抗体のアイソタイプの存在を示し、B細胞の分泌活性と相関しています。

すべての細胞が回収されたら、サブセットを1〜10 x 10 5細胞/ミリリットル濃度で12ウェル細胞培養プレートの個々のウェルに播種します。次に、細胞培養インキュベーターでウェルあたり1 x 10⁶細胞あたり5マイクログラムのCpG(ODN 2006)でB細胞を5日間活性化します。

活性化の最後に、蒸留水中の35%エタノール30マイクロリットルをELISpotプレートの各ウェルに30秒間加えます。次に、各ウェルのエタノールを150マイクロリットルのオートクレーブ二重蒸留水と交換し、プレートを室温で5分間インキュベートして残留エタノールを除去します。PBS洗浄を行い、続いて50マイクロリットルの抗ヒトIgのポリクローナルF(ab')2フラグメントを各ウェルに添加します。

先ほど示したように、プレートをPBSで2回洗浄します。200マイクロリットルの新鮮なPBSとBSAで各ウェルの非特異的結合を室温で2時間ブロックします。別のPBS洗浄シリーズの後、ウェルを摂氏37度で100マイクロリットルの新鮮なRPMI 1640培地でインキュベートします。次に、各ELISpotウェルの培地を適切な数の活性化B細胞に置き換えます。

新鮮なRPMI培地で各ウェルの最終容量を150マイクロリットルにします。次に、ELISpotプレートを細胞培養インキュベーターに8〜14時間戻します。インキュベーション期間の終わりに、培地を廃棄し、200マイクロリットルのPBSとトゥイーン20でウェルを洗浄し、3分間の洗浄を5回行います。

最後の洗浄後、適切な検出抗体を対応するウェルに加え、プレートを暗所で2時間インキュベートします。別のPBS洗浄シリーズの後、50マイクロリットルのBCIP / NBT基質を各ウェルに室温で5〜15分間加えます。

紫色の斑点が現れたら、ウェルあたり100マイクロリットルの二重蒸留水で反応を停止し、流水の水道水ですすいでください。次に、光から保護されたELISpotメンブレンを自然乾燥させます。