マウス脛骨からの骨髄間質細胞の単離と培養

骨髄間質細胞(骨格組織系統の前駆細胞)であるBMSCは、造血幹細胞、分化血球などの不均一な細胞集団とともに骨髄腔内に存在します。

BMSCを単離するには、採取したばかりのマウス脛骨から始めます。骨の近位端と遠位端を切断して、骨髄腔を露出させます。切断した骨を培地を含む適合したマイクロフュージチューブに入れます。

高速で遠心分離して骨から骨髄を洗い流し、チューブの底に骨髄ペレットを形成します。チューブから骨を取り除きます。注射器に取り付けられた針を使用して、骨髄を粉砕して塊を壊します。

懸濁液に培地を加えます。適切なメッシュサイズのセルストレーナーでろ過して、骨片を除去します。骨髄細胞を含む濾液をプラスチック培養プレートにプレートします。

適切な期間のインキュベーション中、BMSCはプラスチック培養プレートの底に付着して増殖しますが、HSCを含む非接着細胞は懸濁液のままです。

非接着細胞を含む培地を廃棄します。トリプシンを使用して、BMSCをプレートから切り離します。トリプシンを不活性化するために血清を含む培地を加えます。遠心分離して上清を廃棄します。

BMSCを新鮮な培地に再懸濁し、細胞を培養プレートに播種します。インキュベートして、BMSCがプレートに付着して単層を形成できるようにします。

すべての骨が収集されたら、サンプルを氷上のPBSに入れ、サンプルを滅菌培養フードに移します。滅菌技術を使用して、各骨の近位端と遠位端の両方に1〜2ミリメートルの切り込みを入れてから、マイクロ遠心チューブ内の各修正マイクロピペットチップに3つの骨を入れます。

遠

心分離によって骨から骨髄を採取し、スピンの終わりに骨髄が各微量遠心チューブの底に完全にペレット化されていることを確認します。骨髄をすべて採取すると、骨は白く見えます。マイクロピペットのチップと骨を収集チューブから取り外し、バイオセーフティを適切に廃棄します。

骨髄細胞をプレーティングするには、まず25ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用してペレットをゆっくりと再懸濁し、塊を分解し、サンプルを1つの15ミリリットルの円錐形チューブにプールします。サンプル500マイクロリットルあたり10ミリリットルの骨髄幹細胞培養培地を加え、70ミクロンのフィルターを通して細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐形チューブにろ過して骨片を除去します。

分割骨髄細胞集団培養をプレーティングするには、1匹のマウスから採取した骨髄細胞を10センチメートルの細胞培養皿に10センチメートルの細胞培養皿に48時間プレーティングします。

培養2日目に、非付着造血幹細胞含有上清を除去し、付着した骨髄細胞を乱さずにプレートをPBSで注意深く洗浄します。PBSを0.25%トリプシンに置き換えます。摂氏37度で1〜3分後、新鮮な細胞培養培地で反応を急冷