iPS細胞由来胸腺移民を作出する3次元胸腺培養システム

iPS細胞由来の胸腺移住者、3D胸腺器官培養システム中の未熟T細胞からのiTEを生成するには、デオキシグアノシン、dGUO処理されたマウス胎児胸腺葉を適切な培地に摂取します。

dGUOは胸腺環境に入り、内因性胸腺リンパ球を破壊し、共培養中のiPS細胞由来の未熟T細胞への干渉を防ぎます。

各胸腺葉の中心に深い切開を行います。ローブを、成長因子幹細胞因子、FLT3リガンド、およびインターロイキン-7を添加した培地を含む新鮮な培養皿に移します。

胸腺葉含有培地を3D培養プレートのウェルにピペットで入れます。iPS細胞由来の未熟T細胞を添加します。インキュベート。T細胞は切開部を介して胸腺葉に移動します。

胸腺環境内では、成長因子であるFLT3リガンドとIL-7が未熟T細胞上のそれぞれの受容体に結合し、転写因子の活性化と特定の遺伝子の発現につながります。

その結果、未熟なT細胞は一連の変化を経て特定の特性を獲得し、最終的にCD8αβ+T細胞に成熟し、CD8分子、T細胞受容体、MHCクラスI分子を表面に発現します。

葉への移動に失敗した未熟なT細胞を取り除きます。

成熟したiTEは胸腺葉から移動し、光学顕微鏡下で葉を取り巻くハローのようなパターンとして視覚化できます。

dGUO治療の7日目に、新しい10センチの皿を4つ取り出します。各皿にミリリットルの完全な培地を入れます。胸腺葉を持つすべてのニトロセルロース膜を1つの10センチメートルの皿に移します。鉗子を使用して、個々のローブを膜から切り離し、培地に沈

めます。

ローブを室温で1時間インキュベートします。次に、胸腺葉を完全な培地を含む新しい10センチメートルの皿に移し、室温で1時間インキュベートします。この移送とインキュベーションをさらに2回繰り返します。

鉗子を使用して胸腺葉を皿に固定し、もう一方の手で中央に100〜200マイクロメートルの深さの切開を行い、葉の直径の半分を伸ばしてT細胞前駆細胞の葉への移動を促進します。

胸腺葉を、完全な分化培地で満たされた新しい10センチメートルの皿に移します。下段と上段のグリッドを備えた3D培養プレートを使用する場合は、ぶら下がっている滴の蒸発と乾燥を防ぐために、両方のグリッドに滅菌PBSを充填します。

次に、1つのdGUO処理胸腺葉を含む30マイクロリットルの完全培地を3D培養プレートの各ウェルに移します。OP9/DLL1共培養から非接着性T系統細胞を回収し、培地20マイクロリットルあたり2,000〜5,000個のT細胞系統細胞の密度で細胞を再懸濁します。20マイクロリットルのT系統細胞懸濁液を3D培養プレートの各胸腺葉に加えます。摂氏37度で5%の二酸化炭素で一晩インキュベートします。

翌日、P200ピペットを30マイクロリットルに設定します。各ウェルの培地を数回上下にピペ