末梢血単核細胞からのナチュラルキラー細胞のEx Vivo増殖

ナチュラルキラーであるNK細胞は、腫瘍や微生物感染を排除する大きな顆粒状リンパ球です。

ex vivo NK細胞増殖のために、NK細胞を含むリンパ球の不均一な集団を含む末梢血単核球(PBMC)の懸濁液を採取します。NK細胞の活性化と増殖に必要な膜結合インターロイキン21、mIL-21を発現する照射されたフィーダー細胞(非増殖リンパ芽球様細胞)を追加します。

底部にガス透過性膜を備えた特殊な培養ウェルに共培養を加え、ガス交換を可能にします。細胞は継代を必要とせずに長期間落ち着き、増殖します。

インターロイキン2、IL-2、およびインターロイキン15、IL-15(NK細胞増殖のためのサイトカイン)を追加します。生理学的条件で適切な期間インキュベートします。

フィーダー細胞上のmIL-21は、NK細胞上の特定のヘテロ二量体受容体に結合します。外因性IL-15およびIL-2は、それぞれの受容体に結合します。この結合は、さまざまな下流のシグナル伝達経路を誘導し、遺伝子発現を活性化し、細胞の老化を制限し、NK細胞の増殖を延長します。

フローサイトメトリーを使用して、一定の時間間隔でNK細胞の増殖を評価します。

記録されたデータをプロットして、細胞の増殖速度とその純度(標的NK細胞型の選択的増殖)を分析します。潜伏期間にわたる多岐にわたる膨張は、高純度を維持しながら持続的な増殖を示しています。

末梢血単核球(PBMC)と100ガンマ線照射された221-mIL-21細胞100個を、10ミリリットルのR-10培地で400 gで5分間遠心分離することにより、別々に洗浄します。

遠心分離後、フローサイトメトリー用に1 x 10⁶ PBMCを保存し、5 x 10⁶ PBMCを10 x 10⁶ 100ガンマ線照射221-mIL-21細胞と特殊な6ウェルプレートで混合します。ヒトインターロイキン-2およびヒトインターロイキン-15を添加したR-10培地30ミリリットルを同じ6ウェルプレートに加え、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベートし、3〜4日ごとに培地を交換します。

インキュベーション中、末梢血ナチュラルキラーまたはPBNK細胞の総数、生存率を記録し、3〜4日ごとにフローサイトメトリーを実行してNK細胞増殖率を計算します。