フローサイトメトリーによるヒトサイトカイン誘導キラー細胞のCDマーカー認識

サイトカイン誘導キラー (CIK) 細胞は、特定のサイトカインとモノクローナル抗体で刺激された末梢血単核細胞 (PBMC) 培養物から ex vivo で生成される不均一な免疫細胞集団です。CIK細胞は、CD3+CD56+ NK-T細胞、CD3+CD56-T細胞、CD3-CD56+ NK細胞などの細胞集団で構成される。

CIK細胞の割合を決定するには、PBMC由来のCIK細胞懸濁液を含むチューブから始めます。異なる蛍光色素およびそれらの混合物に結合した抗CD3抗体および抗CD56抗体を指定されたチューブに加えます。特異的抗体として類似の蛍光色素に結合したアイソタイプコントロール抗体を他のチューブに加えます。

蛍光標識抗CD3抗体および抗CD56抗体は、CIK細胞集団で発現するCD3およびCD56をそれぞれ認識し、結合します。アイソタイプコントロール抗体は標的抗原特異性を欠いているため、非特異的なバックグラウンドシグナル測定が容易になります。

凝集体の除去に役立つ細胞ストレーナーキャップ付きの丸底チューブに細胞をピペットで入れます。チューブをフローサイトメーターカルーセルにロードします。実行中、各セルはチャネルを通過してレーザービームに遭遇し、光を散乱させます。

1 つの検出器は、セルのサイズを示す前方散乱光強度を測定します。もう 1 つは、レーザー ビームに垂直な側面散乱光強度を測定し、セルの粒度を示唆します。この情報は、免疫細胞集団を特定するのに役立ちます。

同時に、特定の励起波長のレーザービームが細胞上の蛍光色素結合抗体を励起し、蛍光シグナル放出を引き起こして検出します。

細胞上の特定の蛍光強度の分析により、CIK細胞亜集団の割合が決定されます。

テキストプロトコルに記載されているように、CIK細胞の調製からこの手順を開始します。次に、CIK細胞を10ミリリットルの滅菌PBSで洗浄します。300倍g、摂氏18〜20度で10分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を5ミリリットルのPBSで再懸濁します。細胞数をカウントし、トリパンブルー排除アッセイを使用して細胞生存率をテストします。

CIK細胞をPBS1ミリリットルあたり約0.5〜100万個の細胞の密度で6本の滅菌1.5ミリリットルチューブに分注します。テキストプロトコルに詳述されているように、細胞にラベルを付けて処理します。1ミリリットルの滅菌ピペットで少なくとも3回上下に穏やかにピペッティングすることにより、CIK細胞を抗体と穏やかに混合します。細胞を室温で暗所で15分間インキュベートします。

チューブを300倍g、摂氏18〜20度で10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、細胞ペレットを1ミリリットルのPBSで再懸濁します。次に、1ミリリットルの滅菌ピペットで細胞を少なくとも3回上下に穏やかにピペットします。細胞懸濁液を、キャップを通して穏やかにピペッティングして、細胞ストレーナーキャップ付きの滅菌5ミリリットルポリスチレン丸底チューブに移します。次に、チューブをカルーセルに順番に置きます。

フローサイトメトリー解析ソフトウェアを開き、実験フォルダーを作成します。次に、「新しい標本」ボタンをクリックして、標本とチューブを実験に追加します。テキストプロトコルに記載されているようにチューブに名前を付けます。

CIK細胞集団の散乱ゲーティングシステムを作成するには、まずチューブ1を選択し、ドットプロットボタンをクリックしてFSC-A/SSC-Aプロットを作成します。細胞破片を除外するために、FSC-Aしきい値が5,000を超える細胞集団全体に長方形のゲートを描画します。

新しいドット プロットの FSC-A/FSC-H パラメーターを選択し、すべての単一セルの周囲にポリゴン ゲートを描画します。新しいヒストグラムプロットのカウント対FITC共役(CD3)およびカウント対APC共役(CD56)パラメーターを選択します。新しいドットプロットのFITC共役(CD3)とAPC共役(CD56)パラメータを選択し、4つのサブ母集団を定義する4象限ゲートを描画します。

各検体の20,000個の単一細胞からのデータを記録します。「サンプルのロード」ボタンをクリックして、最初にブランクのコントロールサンプルを分析します。CD56およびCD3チャネルパラメータを使用して、CIK細胞集団全体を同定します。個々の検体の統計値を含むファイルを開き、CIK細胞集団を分析し、分析ファイルに再印刷します。