マウスリンパ器官におけるインターフェロン-ガンマ分泌物の同定のためのアッセイ

リンパ球のT細胞とナチュラルキラー細胞またはNK細胞によって分泌されるサイトカインであるインターフェロンガンマ(IFN-γ)は、病原体に対する免疫応答を媒介します。

situ IFN-γ産生を研究するには、モデル抗原であるオボアルブミンを認識する受容体を発現するように操作された蛍光標識T細胞を移植したマウスを取ります。

オボアルブミンを発現するように遺伝子組み換えされた病原菌の懸濁液をマウスに静脈内注射し、全身感染症を引き起こします。循環する細菌は脾臓(二次リンパ器官)に到達し、免疫細胞との相互作用を促進することで病原体の除去を助けます。

抗原提示細胞は細菌を飲み込み、抗原を表示します。T細胞は、その受容体を介して抗原に結合し、活性化され、IFN-γを産生します。

細菌に感染したマクロファージ細胞は、免疫メディエーターを放出し、その表面の活性化リガンドをアップレギュレートします。これらのシグナルとの相互作用により、NK細胞は活性化され、IFN-γを生成します。

細胞内タンパク質輸送阻害剤を注射してIFN-γ分泌を制限し、その細胞内蓄積を引き起こします。

マウスの脾臓を収穫します。組織を固定し、凍結して切片化を助けます。クライオミクロトームを使用して、薄い組織切片を作成し、スライドガラス上に置きます。表面マーカーに結合するNK細胞特異的抗体と、細胞内IFN-γを染色するIFN-γ特異的抗体を添加します。これらの抗体は、異なる蛍光色素で標識されています。

スライドを蛍光顕微鏡下に置き、NK細胞およびT細胞内のIFN-γを検出します。

固定液を廃棄し、5ミリリットルのPBSを室温で5分間、穏やかに攪拌しながら加えます。次に、PBSを5ミリリットルの30%スクロースに置き換え、組織の形態を維持するために12〜24時間インキュベートします。これで、臓器はプレートの底に沈みます。

サンプルを凍結するには、ドライアイスを大きな容器に入れ、その中に約50ミリリットルの純粋なメタノールと数個のドライアイスを入れた小さな容器を入れます。糸くずの出ないワイプで脾臓をやさしく乾かします。ベース型の底にOCTコンパウンドを一滴垂らし、脾臓を型の中に置きます。気泡が出ないように注意してください。

脾臓の上に約1ミリリットルのOCTを追加します。鉗子を使用して、メタノールがOCTに触れないように、ドライアイスバス内のメタノールの表面にベースモールドを堆積させます。OCTは冷凍すると厚くなり、白くなります。アーティファクトを最小限に抑えるために、組織をできるだけ早く凍結することを忘れないでください。

クライオミクロトームで、摂氏マイナス21度の温度に設定します。組織を約10マイクロメートルの希望の厚さに切断します。ブラシを使用してガラス顕微鏡スライドに切片を収集し、目視で検査します。セクションを室温に戻します。

の外側の組織切片の周りに、PAPペンなどの液体ブロッカーで円を描きます。組織が乾燥したら、組織切片に100マイクロリットルのPBSを5分間滴下してサンプルを再水和します。次に、吸引によって切片からPBSを除去し、サンプル切片ごとに100マイクロリットルのブロッキング溶液を追加します。屋根付きの湿式チャンバーで室温で最低1時間インキュベートします。

一次抗体で染色するには、ブロッキング溶液を各サンプル用に調製した一次抗体ミックスに置き換えます。原稿に従って洗浄する前に、室温で4時間、または屋根付きの湿式チャンバーで摂氏4度で一晩インキュベートします。

次に、目的の二次抗体を最適な濃度(通常はブロッキング溶液中で1ミリリットルあたり2.5マイクログラム)に希釈します。切片から最終洗浄液を取り出し、調製した二次抗体混合物を切片の上に加え、蓋付きの湿ったチャンバー内で室温で1〜4時間インキュベートします。

原稿に従って洗浄バッファーで洗浄した後、洗浄液を取り除き、PBSで最終洗浄を行います。リン酸緩衝生理食塩水を吸引し、切片が完全に乾燥することなく残りのPBSを蒸発させます。

スライドの裏側にあるセクションの周りに円を描きます。次に、サンプルの上に封入剤を一滴垂らし、培地がセクション全体を覆っていることを確認し、その上にカバーガラスを慎重に置きます。サンプルを暗所で室温で一晩重合させます。

朝、スライドを倒立スペクトルレーザー走査顕微鏡の下に置きます。サイトカインの細胞内局在を分析するために、目的を10x/NA 0.40または60x/NA 1.4に調整します。