マウス全血からの血小板の精製と活性化

血管損傷後、血小板が動員され、損傷部位で活性化され、血小板プラグが形成され、組織修復が開始されます。

マウス全血から血小板を精製し、in vitroで活性化するには、適切な密度勾配培地を服用します。血液サンプルを培地の上に慎重に重ねます。遠心分離機で血小板を血漿から分離し、赤血球層と白血球層を分離します。

血

小板を適切な染色バッファーを含む2つの新しいチューブに移します。グリシン-プロリン-アルギニン-プロリンアミノ酸配列を含む合成GPRPテトラペプチドを1本のチューブに加え、続いてトロンビンを加えます。

トロンビンは、血小板表面トロンビン受容体の特定の細胞外ドメインを切断し、下流のシグナル伝達カスケードを開始し、血小板を活性化します。活性化された血小板の顆粒はCD62Pタンパク質を放出し、膜表面に急速に移動します。

GPRP テトラペプチドは、フィブリノーゲン (活性化された血小板上の膜にまたがるインテグリン CD41/CD61 に結合して血小板凝集を開始する糖タンパク質) をブロックし、それによって活性化された血小板を懸濁液に維持します。

蛍光標識抗CD41抗体および抗CD62P抗体を血小板含有チューブに加えます。

抗CD41抗体は、安静時および活性化血小板にユビキタスに発現するCD41に結合します。ただし、抗CD62Pは、活性化された血小板の膜表面に転座したCD62Pに特異的に結合します。

フローサイトメトリーを使用して細胞を分析します。安静時血小板はCD41+細胞として現れますが、活性化血小板はCD41+ CD62P+細胞として特徴付けられます。

血小板を精製するには、ワイドボアのピペットチップを使用して、採取したばかりの全血200マイクロリットルを、1.5ミリリットルのチューブの側面に沿って600マイクロリットルのイオヘキソール勾配培地に混合せずにゆっくりと重ねます。

ス

イングバケットローターで遠心分離して血小板を分離した後、新しいワイドボアピペットチップを使用して、白血球または赤血球層を吸引せずに、血小板に富む層の大部分と血小板の貧乏層のごく一部を収集します。血小板サンプルを新しいチューブに追加し、1ミリリットルのPBSを血小板に加えます。

別の遠心分離を行う前に、血小板を反転して混合します。次に、穏やかなピペッティングでペレットを200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。血小板の活性化のために、1〜2倍10の6番目の血小板を100マイクロリットルの染色バッファーを含む新しいチューブに移します。0.4ミリモルのGPRPペプチドを添加した100マイクロリットルの染色バッファーを含む別のチューブに、6番目の血小板に1〜2倍10を加えます。

GPRPペプチドを含むチューブにトロンビンを加えて血小板を活性化し、目的の抗体カクテルを両方のチューブに加え