JoVE 実験百科事典
免疫学
0 回視聴 • 4:25 分 • July 8th, 2025
精巣の精細管には、生殖細胞に栄養を与えるセルトリ細胞が含まれています。セルトリ細胞はタイトジャンクションを介して接続されており、ヒアルロン酸が豊富な基底マトリックスにしっかりと付着しています。このセルトリ細胞の配置は、尿細管への免疫細胞の侵入を調節し、発達中の生殖細胞を分解から保護します。
セルトリ細胞を単離するには、マウス精巣由来の部分的に消化された精細管を含むチューブから始めます。これらの尿細管には、精細管を取り囲む平滑筋細胞である尿細管周囲細胞が欠
けています。ヒアルロン酸の加水分解に不可欠なヒアルロニダーゼとDNaseを含む酵素カクテルで尿細管を処理します。
ヒアルロニダーゼが尿細管に入り、基底多糖類であるヒアルロン酸を切断し、基底マトリックスからのセルトリ細胞の剥離を開始し、生殖細胞を溶液中に放出します。DNaseは溶液からDNA汚染物質を消化し、細胞の凝集を防ぎます。
酵素的に消化された尿細管を緩衝液で洗浄し、残留酵素、細胞断片、生殖細胞を除去します。消化した尿細管を再懸濁し、懸濁液をニードルシリンジアセンブリにロードします。
溶液を繰り返し通過させて流体力学的せん断を生み出し、セルトリ細胞のタイトジャンクションを破壊し、残存生殖細胞とともに単一細胞として放出します。
細胞懸濁液をろ過し、細胞破片を除去し、単一細胞懸濁液を得る。濾液を遠心分離して細胞をペレット化します。
セルトリ細胞の選択的増殖のために、細胞を無血清増殖培地に再懸濁します。
セルトリ細胞を単離するには、新しい25ミリリットルのピペットを使用して、沈降した尿細管を25ミリリットルのPBSに完全に再懸濁します。尿細管をさらに12分間沈殿させた後、同じピペットを使用して尿細管を同じ方法でさらに3回洗浄します。次に、尿細管を新しい 100 ミリリットルのスクリューキャップ ボトルに移し、ヒアルロニダーゼ-DNase-I 溶液を加えます。さらに、摂氏32度の振とう水浴で尿細管を5分間消化します。
懸濁液のアリコートを光学顕微鏡検査で100倍倍率で確認します。短い尿細管、管状凝集体、および放出された細胞が見えるはずです。管状骨材を10分間沈殿させます。次に、新しい25ミリリットルピペットを使用して上清を除去し、凝集体を25mlのPBSで4回洗浄し、各洗浄の間に10分間沈降させます。
汚染されたPTCの個体数は減少するでしょう。最後の洗浄後、20mlのRPMI 1640培地を細胞に加え、懸濁液を20ミリリットルの注射器に取り付けられた18G針に10回通します。次に、すべての凝集体が解離したことをすばやく確認し、70ミクロンの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過して、純粋な単一細胞懸濁液を取得します。
25ミリリットルのピペットを使用して、濾液を回転させ、上清を注意深く吸引します。次に、単離されたセルトリ細胞を40mlの無血清RPMI 1640培地に再懸濁します。次に、トリパンブルー除外によって生細胞の数をカウントし、細胞濃度を1ミリリットルあたり3 x 106細胞に調整します。最後に、6ウェルプレートにウェルあたり1ミリリットルの細胞を供給します。