ヒト末梢血単核細胞からのCD4⁺ Vδ1⁺ γδ T細胞の選択的単離

γδ T 細胞は、可変ドメインと定数ドメインを持つガンマ鎖とデルタ鎖を含む T 細胞受容体 TCR を発現します。

CD4+ Vδ1+ T細胞(γδT細胞亜集団)は、可変Vδ1鎖とCD4共受容体を共発現します。これらの細胞は炎症を起こした組織に移動し、機能的に成熟したCD4+またはCD8+ αβ T細胞に分化転換し、免疫応答を媒介します。

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)からCD4+ Vδ1+ T細胞を単離するには、細胞を緩衝液に再懸濁します。Fcブロッキング試薬を使用して、細胞表面のFc受容体をブロックし、非特異的抗体結合を防ぎます。

γδ T細胞のVδ1抗原に結合する蛍光色素FITCと結合した抗Vδ1抗体を追加します。Vδ1 T細胞結合抗体のFITC色素に結合する抗FITC抗体共役磁気マイクロビーズとインキュベートします。

混合物を磁気カラムに通して、ビーズに結合したVδ1+ T細胞を引き付けます。Vδ1-T細胞は結合していないままで、その後洗い流されます。バッファーをカラムに押し込み、Vδ1+ T細胞を剥離させて、カラムを強制的に洗い流します。

細胞のCD4補受容体に結合する抗CD4抗体でコーティングされた磁気ビーズで細胞をインキュベートします。チューブを磁石に入れて、ビーズ結合したCD4 + Vδ1 + T細胞を引き付けます。CD4-Vδ1+ T細胞は結合していないままです。

CD4+ Vδ1+ T細胞を培地に再懸濁します。ビーズ剥離試薬を加えて、細胞からビーズを放出します。磁石のチューブを元に戻してビーズを分離します。

CD4+ Vδ1+ 細胞上清を採取して、さらなる分析を行います。

Vδ1 T細胞の単離を開始する前に、PBMCの1 x 10⁶アリコートを使用して、フローサイトメトリーによってドナーサンプル中のVδ1CD4陽性T細胞の頻度を評価します。次に、残りのリンパ球をスピンダウンし、1 x 10⁷細胞あたり60マイクロリットルのMACSバッファーにペレットを再懸濁します。

次に、1 x 10⁷細胞あたり20マイクロリットルのFc遮断試薬で細胞をブロックし、続いて1 x 10⁷細胞あたり10マイクロリットルのFITC結合抗ヒトVδ1抗体を暗闇で摂氏4度で12分間添加します。インキュベーションの最後に、細胞を14ミリリットルのMACSバッファーで洗浄します。

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レットを1 x 10⁷細胞あたり80マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁し、1 x 10⁷細胞あたり20マイクロリットルの抗FITCマイクロビーズを混合して添加します。摂氏4度の暗所で15分間放置した後、10ミリリットルの新鮮なMACSバッファーで細胞を洗浄します。

遠心分離中に、予冷した磁気カラムを500マイクロリットルのMACSバッファーで平衡化します。次に、細胞を500マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁し、カラムの上部に注意深く加えます。

500 マイクロリットルの MACS バッファー洗浄液を 3 回洗浄してカラムをすすぎます。次に、磁石からカラムを取り外し、プランジャーを使用して、1ミリリットルのMACSバッファーを含むVδ1陽性細胞を15ミリリットルのコニカルチューブにすばやく洗い流します。

細胞を2番目のカラムに通した後、25マイクロリットルのCD4ビーズを30秒間渦巻きさせます。次に、ビーズを1ミリリットルのMACSバッファーを含む1.5ミリリットルの反応チューブに移し、チューブを磁石の上に置きます。

1分後、200マイクロリットルのピペットを使用して上清を注意深く吸引し、ビーズを25マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。次に、単離されたVδ1陽性細胞をスピンダウンし、ペレットを500マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。細胞をビーズと激しく混合します。次に、摂氏 4 度で 20 分間、一定に傾けながら、チューブを磁石の上に戻します。

サンプル量の損失を回避し、汚染されたCD4陰性細胞の存在を最小限に抑えるために、残りのバッファーを蓋の内側からバイアルにピペットで戻すことが不可欠です。

2分後、200マイクロリットルのピペットを使用して、CD4陰性のVδ1陽性細胞含有上清を新しいチューブに移します。次に、CD4陽性細胞を磁石から取り出し、500マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。

先ほど示したように、CD4陰性細胞をさらに2回除去した後、CD4陽性細胞を100マイクロリットルの培地と10マイクロリットルのビーズ剥離溶液で室温で一定に傾けながら45分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、細胞を磁石に1分間戻し、200マイクロリットルのピペットを使用して、ビーズフリーのVδ1陽性CD4陽性細胞含有上清を新しいチューブに移します。

先ほど示したように、残りのビーズをさらに2回取り除いた後、セルをスピンダウンします。次に、Vδ1陽性CD4陽性細胞を新鮮な予熱培地に再懸濁して計数します。