ヒト末梢血単核細胞からのCD4⁺ Vδ1⁺ γδ T細胞の選択的単離

γδ T 細胞は、可変ドメインと定数ドメインを持つガンマ鎖とデルタ鎖を含む T 細胞受容体 TCR を発現します。

CD4+ Vδ1+ T細胞(γδT細胞亜集団)は、可変Vδ1鎖とCD4共受容体を共発現します。これらの細胞は炎症を起こした組織に移動し、機能的に成熟したCD4+またはCD8+ αβ T細胞に分化転換し、免疫応答を媒介します。

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)からCD4+ Vδ1+ T細胞を単離するには、細胞を緩衝液に再懸濁します。Fcブロッキング試薬を使用して、細胞表面のFc受容体をブロックし、非特異的抗体結合を防ぎます。

γδ T細胞のVδ1抗原に結合する蛍光色素FITCと結合した抗Vδ1抗体を追加します。Vδ1 T細胞結合抗体のFITC色素に結合する抗FITC抗体共役磁気マイクロビーズとインキュベートします。

混合物を磁気カラムに通して、ビーズに結合したVδ1+ T細胞を引き付けます。Vδ1-T細胞は結合していないままで、その後洗い流されます。バッファーをカラムに押し込み、Vδ1+ T細胞を剥離させて、カラムを強制的に洗い流します。

細胞のCD4補受容体に結合する抗CD4抗体でコーティングされた磁気ビーズで細胞をインキュベートします。チューブを磁石に入れて、ビーズ結合したCD4 + Vδ1 + T細胞を引き付けます。CD4-Vδ1+ T細胞は結合していないままです。

CD4+ Vδ1+ T細胞を培地に再懸濁します。ビーズ剥離試薬を加えて、細胞からビーズを放出します。磁石のチューブを元に戻してビーズを分離します。

CD4+ Vδ1+ 細胞上清を採取して、さらなる分析を行います。

Vδ1 T細胞の単離を開始する前に、PBMCの1 x 10⁶アリコートを使用して、フローサイトメトリーによってドナーサンプル中のVδ1CD4陽性T細胞の頻度を評価します。次に、残りのリンパ球をスピンダウンし、1 x 10⁷細胞あたり60マイクロリットルのMACSバッファーにペレットを再懸濁します。

次に、1 x 10⁷細胞あたり20マイクロリットルのFc遮断試薬で細胞をブロックし、続いて1 x 10⁷細胞あたり10マイクロリットルのFITC結合抗ヒトVδ1抗体を暗闇で摂氏4度で12分間添加します。インキュベーションの最後に、細胞を14ミリリットルのMACSバッファーで洗浄します。

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レットを1 x 10⁷細胞あたり80マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁し、1 x 10⁷細胞あたり20マイクロリットルの抗FITCマイクロビーズを混合して添加します。摂氏4度の暗所で15分間放置した後、10ミリリットルの新鮮なMACSバッファーで細胞を洗浄します。

遠心分離中に、予冷した磁気カラムを500マイクロリットルのMACSバッファーで平衡化します。次に、細胞を500マイクロ