ヒト好中球細胞外トラップを作製するIn Vitro技術

好中球細胞外トラップ(NET)は、病原体を捕捉して中和する抗菌タンパク質と複合体を形成したクロマチン線維のウェブ状構造です。NET は好中球 (特殊な細胞質顆粒に抗菌タンパク質を貯蔵する免疫細胞) によって分泌されます。

NET形成をin vitroで研究するには、単離された好中球の懸濁液を服用します。酢酸ミリスチン酸ホルボール(PMA)を加えます—親油性炎症誘発性化合物。細胞をプレートし、インキュベートします。

PMAは好中球膜を通過して細胞質に入り、そこでプロテインキナーゼCまたはPKCに結合して活性化します。

活性化されたPKCは、NADPHオキシダーゼ(酵素複合体)の細胞質成分をリン酸化する下流のシグナル伝達を誘導し、原形質および顆粒膜上での集合を引き起こします。この複合体は活性酸素種またはROSを生成します。

ROSは、顆粒からプロテアーゼと抗菌タンパク質の放出を引き起こします。粒状プロテアーゼは、ROS活性化シトルリン化酵素とともに、核に移動します。

粒状プロテアーゼはヒストンの部分分解を引き起こし、シトルリン化酵素はヒストンのシトルリン化を促進し、正電荷を中和します。これらの修飾によりヒストンと DNA の相互作用が破壊され、クロマチンの縮合が解消されます。

核層の修飾は核膜の破裂とクロマチンの外部化を引き起こし、クロマチンは細胞質抗菌タンパク質と混合してNETを形成します。細胞膜の透過処理により、NET の細胞外放出が引き起こされます。

底に付着したNETや好中球を乱すことなく培地を廃棄してください。接着した成分をバッファーに再懸濁します。

遠心分離して細胞を沈殿させ、NETに富む上清を下流のアッセイに使用できます。

好中球細胞外トラップ(NET)の形成を刺激するには、20ミリメートルのグリッドを備えた150ミリメートル×25ミリメートルの平らな組織培養皿に30ミリリットルの好中球懸濁液に500ナノモルのPMAを加えます。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素の下で4時間インキュベートします。

インキュベーション後、皿の底に付着したNETと好中球の層を破壊しないように注意しながら、培地を穏やかに吸引して廃棄します。次に、ピペットを使用して、カルシウムとマグネシウムを含まない15ミリリットルの冷たいPBSで各皿の底を洗浄します。付着材料はすべて底から取り除く必要があります。

洗浄懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに集め、摂氏4度で10分間450 x g で遠心分離します。好中球と残りの細胞は底にペレット化し、細胞のないNETが豊富な上清を残します。

次に、上清を複数の1.5ミリリットルチューブにデカントし、摂氏4度で18,000 x g で10分間遠心分離してDNAをペレット化します。上清を廃棄し、濃度がPBS100マイクロリットルあたり2