マウスの歯のブロックからの歯肉免疫細胞ネットワークの分離

歯肉、または歯肉組織は、歯の頸部部分と顎の骨を取り囲んでいます。

歯肉組織は上皮層で構成され、コラーゲン IV が豊富な基底膜によって下にある結合組織から分離されています。歯肉結合組織には、リンパ球、肥満細胞、歯肉を感染症から保護する好中球などの免疫細胞ネットワークが含まれています。

歯肉免疫細胞ネットワークを分離するには、しっかりと付着した歯肉組織を含むマウスの歯ブロックを取ります。ブロックを4型コラゲナーゼとDNaseを含む酵素カクテルで処理します。

コラゲナーゼが組織に入り、コラーゲンIVを分解し、基底膜と歯肉上皮を破壊し、歯肉を歯から緩めます。一方、DNase は DNA 汚染物質を分解します。チューブにキレート剤を追加します。二価カチオンを除去し、細胞凝集を防ぎます。

消化された歯のブロックをDNase培地を含むシャーレに移します。歯ブロックから歯肉組織を抽出し、細胞ストレーナーに移します。

プランジャーを使用して、ティッシュをつぶします。この機械的解離により歯肉結合層が破壊され、組織から免疫細胞が放出されます。ストレーナーを培地で洗浄し、放出された細胞を濾液に集めます。

濾液を遠心分離し、細胞をペレット化し、残留酵素や破片を含む上清を廃棄します。免疫細胞を運ぶ細胞集団を完全な培地に再懸濁し、将来の分析に備えます。

歯肉の境界から余分な組織を取り除き、上顎ブロックと下顎ブロックを氷上の5ミリリットルのコラゲナーゼとDNaseを含む50ミリリットルの円錐形のチューブに移します。組織を摂氏37度のシェーカーインキュベーターで1時間消化し、最後の5分間に50マイクロリットルの0.5モルEDTAを加えます。次に、5ミリリットルの冷たいDNase培地を組織に加え、チューブの内容物を旋回させながら穏やかに混合します。次に、4つの組織ブロックをペトリ皿に移し、500マイクロリットルの新鮮なDNase培地で覆います。

メスを使用して組織の各ブロックから歯肉を取り除き、皿の内容物全体を50ミリリットルのチューブの上にある70ミクロンの細胞ストレーナーに移します。ペトリ皿とストレーナーを3〜5ミリリットルの新鮮なDNase培地で洗浄し、滅菌3ミリリットルシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナーのメッシュに対して歯肉組織をマッシュします。ストレーナーを30〜35ミリリットルの冷たいDNase培地ですすぎ、濾液を遠心分離します。次に、ペレットを1ミリリットルの完全培地に再懸濁し、生細胞の数を決定します。