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マクロファージ細胞外トラップ (MET) は、病原体を捕捉して排除するためにマクロファージによって放出されるウェブ状の構造です。
METは、マトリックスメタロプロテイナーゼ-9、MMP-9、およびシトルリン化ヒストンH3、H3Cit(アルギニンがシトルリンに変換される修飾ヒストンタンパク質)に関連する細胞外クロマチン線維で構成されています。
ホルマリン固定、パラフィン包埋マウス肺組織切片のMETを特徴付けるには、まずスライドを乾燥させます。キシレンに浸漬して切片を脱パラフィンします。エタノール水溶液を使用して切片を再水和します。
切片を加熱してホルマリン誘導タンパク質架橋を切断し、その後の抗体結合のために標的抗原を露出させます。
タンパク質含有溶液を加えて、非特異的結合部位をブロックします。抗MMP-9、抗H3Cit、および抗F4/80一次抗体のカクテルでインキュベートします。
抗F4/80抗体は、マクロファージ細胞表面糖タンパク質F4/80に結合します。抗MMP-9抗体と抗H3Cit抗体は、METでそれぞれMMP-9とH3Citに結合します。標的に結合したそれぞれの一次抗体に結合する、異なる蛍光色素結合二次抗体を追加します。
DAPI含有封入剤でセクションをマウントします。DAPIはMETのクロマチン線維を染色します。共焦点顕微鏡を使用して、切片を画像化し、METマーカーの蛍光を視覚化します。
METは、細胞外クロマチン線維とF4 / 80、MMP-9、およびH3Citの共発現によって特徴付けられます。
FFPEサンプルを抗原回収液で前処理するには、スライドを摂氏60度で60分間オーブン乾燥させます。次に、スライドをキシレン溶液に30分間移し、その後、サンプルを室温で70%エタノールに5分間移します。
水道水でスライドをすすぎた後、耐熱ラップに入れ、Tris-EDTA pH 9.0の圧力鍋に10分間入れて抗原回収量を高めます。サンプルを20分間冷却し、水道水に移します。次に、ロッカーの上に5分間置きます。水道水洗浄を繰り返してから、ロッカーのPBSでスライドを一度洗浄します。
サンプルをブロックするには、10%の鶏血清を5%BSA / PBSに加え、室温で30分間インキュベートします。次に、マクロファージの細胞外トラップ、またはマクロファージのMETを定義するために、1%BSA / PBSに1〜100希釈の一次抗体を加え、スライドを摂氏4度で16時間インキュベートします。
PBSを使用して、サンプルをロッカーで5分間2回洗浄します。対応する蛍光二次抗体を1%BSA/PBSに加え、スライドを室温で40分間インキュベートします。PBS洗浄後、DAPI含有封入剤を使用してクロマチンを染色し、サンプルを封印します。
倒立顕微鏡に取り付けられた共焦点レーザー走査ヘッドを使用して、20X 0.1 NAの空気と40X 1.0 NAのオイル対物レンズを使用して蛍光画像をキャプチャします。単一平面の 512 x 512 ピクセルの画像をキャプチャするには、ラインシーケンシャルのレベリングボタンをクリックします。各結果の分析とデータのために、セクションごとに少なくとも 10 の視野を取得します。