Gamma Delta上皮内リンパ球の生体内可視化

ガンマデルタ上皮内リンパ球(γδ IEL)は、ガンマデルタT細胞受容体を発現する特殊な遊走性T細胞です。これらの細胞は主に腸上皮内に見られ、上皮をパトロールして腸全体の病原体の転座を制限します。

生体内のγδIELを視覚化するには、小腸を部分的に露出させた麻酔をかけたトランスジェニックマウスから始めます。トランスジェニックマウスは、γδ IELのみでレポータータンパク質(強化された緑色蛍光タンパク質)を発現するように遺伝子組み換えされ、それらの追跡が可能になります。

電気焼灼を使用して、露出した小腸に逆腸表面に沿って穿孔線を作成し、過度の出血を防ぎます。

穿

孔線を縦方向に切開して腸粘膜を露出させ、複数の指のような突起(絨毛)を示します。各絨毛には、腸管腔に突き出たγδ IELが常駐する上皮細胞が含まれています。

露出した粘膜表面を蛍光色素と直接接触させたマウスを配置し、内腔に赤色蛍光を与えます。

共焦点顕微鏡でマウスを画像化します。絨毛の先端上皮から始めて、Z軸に沿って異なる焦点面で絨毛と画像を見つけます。これらの光学セクションを組み合わせて、3D画像を作成します。

生体内イメージングは、赤色内腔近くの上皮細胞の基底膜に沿った緑色蛍光γδIELの動的な動きを示しています。

血管

の間の下にある腸間膜の両側に2対の鉗子を置き、鉗子の先端をそっとこすり合わせて膜に穴を開けます。角度の付いた鉗子と、5センチメートルの縫合糸に取り付けられた湾曲したテーパーポイント針を使用して、膜の穴から腹膜の片側を貫通し、腹膜の内層の反対側を上に挿入し、切開部の上部に1本、下部近くにもう1本の縫合糸を配置して、腸のループを外部化したまま切開部を閉じます。

成功の可能性を高めるために、腹部構造を配置している間、血管を結んだり引き裂いたりせず、腸の無関係な取り扱いを制限してください。

次に、同じ方法で腸ループの下の皮膚を閉じ、下にある腹膜の前の縫合糸の間の切開の中央に1本の縫合糸を配置します。電気焼灼を使用して、抗腸間膜の境界に沿って穿孔の線を作り、すぐに腸の表面に数滴の水を塗布して、追加の熱誘発性組織損傷を防ぎます。

キムワイプで吸い取り、残留水を取り除きます。ヴァンナはさみを使用して、焼灼組織の遠位端に約1.5センチメートルの水平スリットを切り、焼灼線の長さに沿って、外部化組織セグメントの近位端に向かって切ります。粘膜表面が露出したら、湿らせたキムワイプで腹部を覆い、組織の水分を保ちます。

スピニングディスク共焦点顕微鏡イメージングの場合は、マウスを覆われた容器内の顕微鏡に運びます。イメージングソフトウェアを起動し、顕微鏡のヘッドを後ろに傾け、ハンクの緩衝生理食塩水中の1マイクロモルフリートAlexaFluor色素をガラスのカバースリップ底に150マイクロリットル加えます。開いた粘膜表面がカバーガラスに直接接触するようにマウスを配置します。

マウスと皿を予熱したインキュベーター内のイメージングステージに置きます。各レーザーの励起強度と露光時間をそれぞれ10〜15ミリワット、120〜150ミリ秒以下に設定し、フレーム平均を「2」に調整します。

電子増殖ゲイン機能をオンにしてバックグラウンドノイズを低減し、63倍の対物レンズキャリブレーションを選択してピクセルサイズを正しく測定します。405ナノメートルのレーザーと20倍の対物レンズを使用して、核を手動で視覚化して、目立った動きやドリフトのない絨毛のフィールドを特定し、呼吸、蠕動運動、または心拍による人工的な動きの領域を回避します。

XYスキャンを使用して、関心のあるフィールドのx-y座標を記録し、グリセロール浸漬63X対物レンズに切り替えます。405ナノメートルチャンネルで最大1分間ライブ画像を取得し、選択したフィールドの絨毛が安定していることを確認しながら、焦点を調整して絨毛先端のすぐ下の直交面を見つけます。

次に、絨毛先端上皮のすぐ下から始めて、約15〜20マイクロメートルから絨毛まで、1.5マイクロメートルのステップで核を分解することが困難になるまで、Zスタックを取得します。取得開始から3〜5分後、画像の安定性、およびガンマデルタ上皮内細胞の運動性を確認し、絨毛の各フィールドについて30〜60分間画像を取得し続けます。