GM-CSF産生ヘルパーT細胞をナイーブT細胞から分化するためのIn Vitro技術

顆粒球マクロファージコロニー刺激因子であるGM-CSFは、GM-CSF産生TヘルパーまたはTHGM細胞によって分泌されます。これらの細胞は、他のヘルパーT細胞特異的サイトカインの発現が低い。

T_HGM細胞のin vitro分化を開始するには、抗原活性化成熟細胞と未分化ナイーブ細胞を含むヘルパーT細胞懸濁液(マウス脾臓から単離)を採取します。

ナイーブ細胞と成熟細胞の特徴的な表面マーカーを標的とする蛍光標識抗体を追加します。蛍光活性化細胞選別を実行して、ナイーブT細胞を単離します。

T細胞受容体複合体に結合する抗体でコーティングされたウェルに細胞をプレーニングします。共刺激受容体に結合する抗体を追加します。相乗的な結合により細胞が活性化されます。

サイトカインであるインターロイキン7を添加し、TH GM細胞への分化とGM-CSF産生を誘導します。酢酸ミリスチン酸ホルボール、炎症誘発性化合物であるPMA、カルシウムイオノフォアであるイオノマイシン、およびタンパク質輸送阻害剤を追加します。

PMAは細胞に入り、プロテインキナーゼを活性化します。膜透過性イオノマイシンは、細胞内のカルシウムイオンを転座させ、細胞内カルシウム濃度を上昇させます。

プロテインキナーゼの活性化と高いカルシウムレベルは、TH GM細胞を再刺激するシグナルを開始し、その結果、GM-CSFの産生が増加します。タンパク質輸送阻害剤はGM-CSF分泌をブロックし、細胞内検出を助けます。

免疫蛍光染色を行い、細胞内サイトカインを検出し、フローサイトメトリーを使用して細胞を分析します。細胞の大部分は高いGM-CSFレベルを示しているが、他のサイトカインの発現が低い場合は、TH GM細胞への分化が成功していることを示しています。

CD4陽性T細胞を単離するには、白血球ペレットを5ミリリットルの細胞単離バッファーに再懸濁し、細胞懸濁液を30マイクロメートルのストレーナーを通して新しい15ミリリットルのチューブにろ過して、破片を除去します。カウント後、緩衝液濃度90マイクロリットルあたり1 x 10⁷細胞で細胞を再懸濁し、1 x 10⁷細胞あたり10マイクロリットルの抗CD4結合磁気ビーズを加えて、摂氏4度で15分間インキュベーションし、5分ごとに混合します。

細胞がインキュベートしている間に、分離カラムを磁気スタンドに置き、2ミリリットルのバッファーでカラムを事前に濡らします。次に、細胞を5ミリリットルの緩衝液で洗浄し、ペレットを1ミリリットルの緩衝液に再懸濁します。サンプルをカラムにロードし、CD4陰性画分を15ミリリットルのコニカルチューブに収集します。

すべての細胞がカラムを通過したら、乾燥する前に洗浄ごとに1ミリリットルのバッファーでリザーバーを3回洗浄します。最後の洗浄後、カラムを新しい15ミリリ