GM-CSF産生ヘルパーT細胞をナイーブT細胞から分化するためのIn Vitro技術

顆粒球マクロファージコロニー刺激因子であるGM-CSFは、GM-CSF産生TヘルパーまたはTHGM細胞によって分泌されます。これらの細胞は、他のヘルパーT細胞特異的サイトカインの発現が低い。

T_HGM細胞のin vitro分化を開始するには、抗原活性化成熟細胞と未分化ナイーブ細胞を含むヘルパーT細胞懸濁液(マウス脾臓から単離)を採取します。

ナイーブ細胞と成熟細胞の特徴的な表面マーカーを標的とする蛍光標識抗体を追加します。蛍光活性化細胞選別を実行して、ナイーブT細胞を単離します。

T細胞受容体複合体に結合する抗体でコーティングされたウェルに細胞をプレーニングします。共刺激受容体に結合する抗体を追加します。相乗的な結合により細胞が活性化されます。

サイトカインであるインターロイキン7を添加し、TH GM細胞への分化とGM-CSF産生を誘導します。酢酸ミリスチン酸ホルボール、炎症誘発性化合物であるPMA、カルシウムイオノフォアであるイオノマイシン、およびタンパク質輸送阻害剤を追加します。

PMAは細胞に入り、プロテインキナーゼを活性化します。膜透過性イオノマイシンは、細胞内のカルシウムイオンを転座させ、細胞内カルシウム濃度を上昇させます。

プロテインキナーゼの活性化と高いカルシウムレベルは、TH GM細胞を再刺激するシグナルを開始し、その結果、GM-CSFの産生が増加します。タンパク質輸送阻害剤はGM-CSF分泌をブロックし、細胞内検出を助けます。

免疫蛍光染色を行い、細胞内サイトカインを検出し、フローサイトメトリーを使用して細胞を分析します。細胞の大部分は高いGM-CSFレベルを示しているが、他のサイトカインの発現が低い場合は、TH GM細胞への分化が成功していることを示しています。

CD4陽性T細胞を単離するには、白血球ペレットを5ミリリットルの細胞単離バッファーに再懸濁し、細胞懸濁液を30マイクロメートルのストレーナーを通して新しい15ミリリットルのチューブにろ過して、破片を除去します。カウント後、緩衝液濃度90マイクロリットルあたり1 x 10⁷細胞で細胞を再懸濁し、1 x 10⁷細胞あたり10マイクロリットルの抗CD4結合磁気ビーズを加えて、摂氏4度で15分間インキュベーションし、5分ごとに混合します。

細胞がインキュベートしている間に、分離カラムを磁気スタンドに置き、2ミリリットルのバッファーでカラムを事前に濡らします。次に、細胞を5ミリリットルの緩衝液で洗浄し、ペレットを1ミリリットルの緩衝液に再懸濁します。サンプルをカラムにロードし、CD4陰性画分を15ミリリットルのコニカルチューブに収集します。

すべての細胞がカラムを通過したら、乾燥する前に洗浄ごとに1ミリリットルのバッファーでリザーバーを3回洗浄します。最後の洗浄後、カラムを新しい15ミリリットルのコニカルチューブに移し、2ミリリットルの細胞分離バッファーでカラムを浸して、陽性のビーズ画分を排出します。次に、遠心分離によってCD4陽性細胞を収集します。

ナイーブT細胞の蛍光活性化細胞選別では、ビーズ選別したCD4陽性細胞ペレットを500マイクロリットルのバッファーに再懸濁し、細胞を適切な蛍光結合抗体カクテルと混合します。光から保護した氷上で20〜30分後、細胞を5ミリリットルの新鮮なバッファーで洗浄し、ペレットを500マイクロリットルの新鮮なバッファーに再懸濁します。

ナイロンメッシュを通して細胞をろ過し、500マイクロリットルのバッファーで事前にコード化されたFACSチューブに細胞を移します。CD4陽性、CD25陰性、CD44低CD62リガンド高細胞集団を選択するためのゲート。次に、ナイーブCD4陽性、CD25陰性、CD-44低、CD-62リガンド高T細胞画分を新しい15ミリリットル遠心分離チューブに選別し、遠心分離によって単離されたナイーブCD4陽性T細胞をペレット化します。

顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、またはGM-CSF、ヘルパーT細胞分化のために、選別されたT細胞を1 x 10⁶細胞/ミリリットル濃度で50マイクロモルのベータ-メルカプトエタノールを含む完全RPMI培地に再懸濁し、事前にコード化された48ウェルプレートの各ウェルから抗CD3イプシロン抗体を吸引します。

次に、2.5 x 10⁵細胞をIL-7、抗CD28、および抗IFNガンマとともに各ウェルに播種し、細胞を摂氏37度、5%CO₂で3日間インキュベートします。培養3日目に顕微鏡で細胞分化を確認し、遠心分離のために細胞を回収します。

ペレットを新鮮な完全RPMI培地に2回洗浄して再懸濁し、カウントのために2回目の洗浄後に細胞を1ミリリットルの新鮮な完全培地に再懸濁します。細胞を3つの等しい体積に分割し、タンパク質輸送阻害剤の存在下で、細胞の最初のアリコートをPMAとイオノマイシンで4〜6時間再刺激します。

刺激の最後に、抗CD4抗体で染色するために細胞を回収します。30分後、細胞を200マイクロリットルの固定バッファーで20〜60分間固定し、続いて洗浄ごとに1ミリリットルの透過処理バッファーで2回洗浄します。次に、暗所で30分間細胞内サイトカイン発現を染色します。