Name: 横方向の流体のパーカッション：マウスにおける外傷性脳損傷のモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 学ぶマウス外傷性脳損傷モデルの横方向流体パーカッション法。開頭術とハブ装着、水圧パルスによる損傷誘導、術後の形態・行動変化評価の手順を解説し、神経科学研究の再現性向上に貢献します。

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この作業は、脳損傷の研究でニュージャージー州委員会によって運営されている。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

LFPの方法は、ここで紹介のneuropathalogicalと行動の成果の多くのモデルは、TBIの広く使用されている動物モデルとなった理由である外傷性脳損傷の軽度から中等度。この手法の妥当性と信頼性を向上させるために考慮すべきいくつかの重要なステップがあります。例えば、硬膜の完全性がクレイニエクトミ中に危険にさらされていないだけで、動物がLFPに供し、研究で使用することが重要です。クレイニエクトミは、任意の接着剤やセメントによって閉塞されている場合、さらに、クレイニエクトミ下硬膜のように一部が流体圧の力にさらされていない、動物は試験から除外されるべきである。最後に、立ち直り反射の時間や死亡率が所望の範囲内にない場合、動物は研究に含まれるべきではない。圧力パルスの強度は、より深刻な怪我を生成するために増加することができます。 図1に示すように、LFPデバイスの設定は比較的単純で、傷害の程度の再現性は、オシロスコープに圧力の雰囲気を監視することによって維持されています。オシロスコープのトレース上の曲線の滑ら​​かな形状は、LFPの傷害の誘導を妨害する可能性流体内に気泡がないことを示しています。テストパルスは、傷害を誘発する前に配信される必要がありますし、オシロスコープのトレースは、滑らかな曲線を示していない場合、気泡を削除する必要があります。パルスの持続時間は、衝突試験のシミュレーションで測定された誘導の時間を表す約20ミリ秒です。短いパルスの傷害はより多くの焦点怪我を生産する可能性があります。 TBIしたがって、パルスのモデルのこの期間は人間。 LFPを以下の形態学的および細胞の変化は、組織への物理的な損傷だけでなく、図2に示すようにアストロサイトとマクロファージ数の増加が含まれています。それは傷害の顕著な兆候の一つは、星状膠細胞とグリア瘢痕の形成の過形成であることが十分に確立されている。グリア瘢痕が有益と有害な影響24の両方を有することが示されている。同様に、マクロファージは、治癒のプロセスが25を開始したとき、位相は、次の怪我の間に様々な組織に蓄積することが知られている。このように偽のコントロールに対する相対LFP試料のGFAPとMAC​​1陽性細胞数の増加は、傷害の誘導の指標である。偽のコントロールで、これらの細胞特異的マーカーの発現の欠如は、単独で手術操作は脳組織の健康上およびタンパク質発現の変化は、傷害のパラダイムに固有の負の結果を持っていないことを示しています。 図3に示す軽度のLFPの行動結果は、認知や運動障害などがあります。 MWMの所見LFPマウスは、最終的にタスクを学ぶことを示しているが偽のマウスよりも遅い速度で、彼らは訓練の後だけでなく、一日の作業を覚えていません。このように、さらに軽度負傷マウスは、その後のテスト中に取得する必要が空間的な情報を、処理の統合、および格納するための外部手がかりを使ってで偽のマウスよりも効率的です。このような条件性恐怖反応のような他の海馬依存の認知タスクはLFP 26に受けたマウスでは損なわれることが示されている。最後に、軽度の損傷後の3週間にロータロッドパラダイムで偽のマウスの相対LFPマウスによって落下する短い待ち時間は、統合されたvestibulomotorと感覚運動機能の障害の指標です。他のグループ27から30によって示されているとして、より多くの中程度の傷害は、認知および運動機能のより顕著な変化を明らかにするだろう。 それが予想される基準の多くを満たしているため合計では、LFPは人間TBIの有効なモデルです。 LFPは、構成概念妥当性を提供するという点では、ヒトにおけるTBI誘導病因のプロセスを再作成します。具体的には、力と死亡率の大きさは、事前に怪我の外科的介入は、動物モデルに対して一意であることを警告と軽度および中等度のスポーツカー関連の負傷で発生しているものと同様である。 LFPはまた、人間のTBIで観測された解剖学的、生化学的、神経病理学的および行動への影響の多くのそのLFP反復するに顔の妥当性を示す。そこにLFP後に検出される焦点とびまん性変化の両方があり、インパクトの左右差は1つが対側のそれと怪我に同側での形態学的損傷を比較することができます。一つ注意点は、認知運動効果を1つだけの半球が負傷の結果として、より微妙な場合があることである。最後に、LFPは、予測的妥当性を示し、LFPの手法の信頼性は、傷害20の誘導の前または後に様々な薬理学的および遺伝的操作の評価が可能になります。このような血圧、血液のpHや血液などの生理学的変数ガスは、治療薬の作用機序を決定するために、テスト薬剤の存在下および非存在下で測定する必要があります。しかし、TBIのプライマリとセカンダリの影響の複雑な性質のため、それはすべての症状を緩和することができる単一の介入を識別することは困難な作業です。 LFPのテクニックの一つ将来の考慮事項は、流体15の振り子によって提供される力を校正するための必要性をなくし、そのような気泡のような運用上の変数を避けるために、マイクロプロセッサ制御、空気圧駆動機器を採用したマイクロ流体パーカッションの使用可能性があります。しかし、標準のLFPのアプローチは、より良い介入や治療につながるTBI以下のダメージと回復の分子メカニズムを探索するために信頼性とシンプルな手法であることが多くの研究者によって証明されています。

<ul><li>マウスの定位アライメント測定器（Kopfはインスツルメンツ） </li><li>マウスのガス麻酔ヘッドホルダー（Kopfはインスツルメンツ） </li><li> O 2フラッシュ（パークランドサイエンティフィック）と麻酔器</li><li> O2フラッシュ（パークランドサイエンティフィック）と麻酔器</li><li> Buprenorphrine（ウェブスターの動物の供給） </li><li>リフレッシュLacri潤滑眼軟膏（フィッシャー） </li><li>ブピバカイン/ Marcaine（ウェブスターの動物の供給） </li><li>ポビドン - ヨウ素溶液（フィッシャー） </li><li> 20グラム1 ½&quot;針（Becton Dickinson社製） </li><li>手術用メスの刃（＃15）とホルダー（ベクトンディッキンソン） </li><li>ブルドッグクランプ（ファイン科学のツール） </li><li>歯科用ツールや骨のスクレーパー（ファイン科学のツール） </li><li>鉗子デュモンを把握する側＃6（ファイン科学のツール） </li><li> 3ミリメートル外径トレフィン（研究の計装屋、ペンシルバニア大学） </li><li>固体ナイロンコード（1.7mmの直径、例えば雑草トリマーライン） </li><li>スーパー接着剤ゲル</li><li>ロックタイトシアノアクリレート接着剤（ロックタイト444徳パック）（ヘンケル株式会社） </li><li>ジェットアクリルリキッド（バトラーシャイン） </li><li>パーマの新しい線を引く/修理樹脂（バトラーシャイン） </li><li>ストレージオシロスコープTDS 1001B、40 MHzの、500ミリ/秒（テクトロニクス） </li><li>外傷デューサ圧力トランスデューサアンプ（カスタム設計と製作、バージニアコモンウェルス大学） </li><li> LFPデバイス（カスタム設計と製作、バージニアコモンウェルス大学） </li><li>高圧チューブ、長さ41センチメートル、ボリューム2ミリリットル（バクスター） </li><li> 3M Vetbond組織接着剤（フィッシャー） </li></ul>

横方向の流体のパーカッション：マウスにおける外傷性脳損傷のモデル

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

外傷性脳損傷（TBI）の研究では、どの罹患率と死亡率の結果頭部外傷の意識の高まりにより、新たな勢いを、達成している。再生のプロセスの1,2に続いているTBI、複雑かつ異種の二次影響の結果、以下の一次的損傷の性質に基づく。一次的損傷は、頭蓋骨の骨折からまたはせん断と動き3,4に起因する脳の変位を引き起こす組織の伸張から脳への直接挫傷により誘導され得る。結果として得られる血腫と裂傷が血管反応3,5を引き起こす、と白質の形態学的および機能的な損傷は、軸索傷害6-8拡散につながる。一般的に脳に見られる追加の二次的変化は、浮腫や頭蓋内圧亢進9です。 TBIは、次の最終的に長期的な神経学的障害を13,14につながる興奮神経伝達物質、免疫メディエーターおよび酸素ラジカル10-12、の放出に関与する生化学および生理学的経路の微視的な変化があります。したがって、ヒトおよびげっ歯類に存在する同様の細胞や分子のイベントはTBIそのTBIの適切な動物モデルを選択すると、損傷および修復のメカニズムを研究するために重要です。 流体パーカッション、皮質への影響及び重量落下/衝撃加速度1：TBIの様々な実験モデルはヒトで観察TBIの局面を再現するために開発されている、それらの間の3つの特定のモデルが広くげっ歯類に適応されています。流体のパーカッションのデバイスは、そのまま硬膜への簡単な流体の圧力パルスを印加することによりクレイニエクトミによって傷害を生成します。パルスは、流体のリザーバーのピストンを打つ振り子によって作成されます。パーカッションは、神経組織1,15の簡単な変位や変形を生成します。逆に、皮質衝撃傷害は、空気圧16,17の下で厳格なインパクターを経由して無傷の硬膜への機械的エネルギーを提供します。重量落下/衝撃モデルは閉じた頭蓋骨18日に特定の質量を持つ棒の落下によって特徴付けられる。 TBIのモデルの中で、LFPは混合焦点とびまん性脳損傷19を評価するために最も確立されたと一般的に使用されるモデルです。それは再現可能であり、傷害のパラメータの操作を可能にするために標準化されています。 LFPの反復するの怪我は、このように、それが臨床的に関連するレンダリング、ヒトで観察し、臨床翻訳20の新規治療薬の探索が可能になります。 我々は、マウスでLFPの手順を実行するための詳細なプロトコルを記述する。与えた損傷は皮質、海馬および最も脆弱である脳梁のような脳の領域で、軽度から中等度です。海馬と運動学習のタスクは、LFPは、次の探索されます。

横方向の流体パーカッション（LFP）、マウスの外傷性脳損傷の確立されたモデルは、実証される。妥当性、信頼性と臨床的関連：LFPは、動物モデルの3つの主要な基準を満たしています。外科的開頭で構成される手順は、ハブの固定は、焦点とびまん性傷害の結果、傷害の誘導が続く記述されています。

頭部外傷への意識が高まっていることで、外傷性脳損傷（TBI）の研究は新たな弾みを付けています。頭部外傷は罹患率および……をもたらします。

この手順の全体的な目的は、マウスに軽度から中程度の脳損傷を誘発し、ヒトの外傷性脳損傷のモデルを作成することです。まずC型開頭術を行うことでこれを達成します。次に、開頭部位の頭蓋骨にハブを取り付けます。次に、脳損傷を誘発するために、ハブを介して水パルスを注入します。手順の最終ステップは、ハブを取り除き、傷口を閉じることです。最終的に、免疫蛍光染色、顕微鏡観察、認知機能および運動能テストを通じて、損傷後のさまざまな間隔における形態学的および行動学的変化を示す結果を得ることができます。一般的に、この手法に不慣れな人は、硬膜を損傷せずに開頭術を行うことや、硬膜に接着剤を付着させずにハブを取り付けることが困難であるため、苦労します。したがって、この技術を視覚的に提示することは非常に価値があります。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者が行います。まず、手術部位の準備から始めてください。手術中に麻酔を継続的に吸入させるため、ガスヘッドホルダーを装着した脳定位固定装置を用意します。次に、必要に応じて手術用顕微鏡と光源を配置します。手術中にマウスの下に敷くウォーミングパッドを準備し、手術部位に接触するすべての器具と材料が滅菌されていることを確認します。手術部位の準備が整ったら、頭蓋骨に取り付け、LFPデバイスに接続するためのハブを作成します。カミソリの刃を使用し、20ゲージ、1.5インチの針の金属端を、わずかに斜めにカットします。ハブの開口部は約3mmにする必要があります。次に、草刈機用のナイロンコードから厚さ約1 mmのディスクを切り出します。これらは、頭蓋骨へのドリリング中にタインを固定するために使用します。マウスに麻酔をかけた後、動物を脳定位固定装置に置き、ノーズコーン内で頭部を固定します。手術中は呼吸数を視覚的にモニタリングすることを忘れないでください。次に、乾燥を防ぐために眼に軟膏を塗布し、頭部の除毛を行います。ポビドンヨード溶液を繰り返し塗布した後、70% alcoholで手術部位を洗浄および滅菌します。手術部位の準備が整ったら、メスを使用して、眼から頸部にかけて正中切開を行います。小さなブルドッグ鉗子で皮膚を牽引します。頭蓋骨を露出させ、術野を明確にするため、歯科用器具またはボーンスクレイパーを用いて頭蓋骨に局所麻酔薬のブピバカインを塗布し、頭蓋骨上部の筋膜を除去します。次に、右半球上のBgmaとLambdaの中間点、および矢状縫合と外側隆起の中間点に印を付けます。プラスチック製ウェボにLoctite接着剤を1滴滴下し、サイド把持鉗子を用いて、あらかじめ準備したディスクの1つを接着剤に浸します。そのディスクを頭蓋骨上の印に合わせて押し当てます。針と注射器を用いて、Loctite Acceleratorを1〜2滴滴下します。接着剤を硬化させるため、外径3 mmのトリフィンをディスクの上に配置し、頭蓋骨を貫通するまで時計回りに回転させます。硬膜を突き破るなど、深く穿孔しすぎるのを防ぐため、頻繁にトレイで進捗を確認してください。軽く押したときに、頭蓋骨片が緩んでいることを確認します。歯科用器具を頭蓋骨の表面に平行に配置し、それを用いて骨片を押し上げます。ピンセットを使用し、頭蓋骨から骨を慎重に切り離します。綿棒で圧迫し、出血を止め、骨粉が硬膜に付着するのを防ぎます。硬膜に明らかな損傷が見られる場合は、人道的な安楽死処置を行い、その個体を実験から除外してください。ピンセットを使用して、ハブの傾斜が頭蓋骨の曲率と一致するように、穴の上にハブを配置します。片手でハブを固定しながら、もう片方の手で先端の尖った木製スティックを使用し、ハブの縁に瞬間接着剤を塗布します。duraの上に接着剤がつかないように注意してください。接着剤がつくと、損傷時の力が弱まったり、後でハブを取り外す際に裂け目が生じたりする可能性があります。小さな紙コップの中で、Sanoアクリルと歯科用アクリルを混ぜ合わせます。1 ccのシリンジを使用して、ハブの周囲にセメントを塗布します。セメントは、ハブの下方2 mmおよび周囲の露出した頭蓋骨を覆うように塗布してください。回復期に硬膜を湿潤状態に保つため、ハブに滅菌生理食塩数を満たします。溶液の液面が維持できない場合は漏れの可能性が高いため、新しいハブを取り付けて動物への液体投与を完了させ、ワイヤーリッドのない保温済みの空ケージに移してください。底に少量のハイドロゲルを配置し、マウスを1〜2時間回復させます。LFPデバイスの構成部品は、ペンデュラム、高圧チューブとオスルアーロック継手を取り付けた水充填アクリルシリンダー、アンプリファイア、およびオシロスコープです。まず、オシロスコープとアンプの電源を入れます。LFPデバイスおよびそれに接続された高圧チューブに水が満たされており、ルアーロックチューブのオス側端を用いて気泡が完全に除去されていることを確認してください。振り子を放し、テストパルスを印加します。数回のパルスを照射し、オシロスコープとアンプでペンジュラムがスムーズな信号を出しているか確認します。信号にノイズがある場合はシステム内に気泡が存在することを示しており、損傷パルスを照射する前に除去する必要があります。損傷の整合性を維持するため、デバイスによって照射される圧力をモニターしてください。ここでのオシロスコープのトレースは、ピークツーピーク値が2.16 voltsであることを示しており、これは圧力が1.47 atmospheresであることを意味します。パルスの強度を調整するために、振り子の角度を大きくしたり小さくしたりすることができます。ここでは、角度は約10度です。LFPデバイスの調整後、必ずチューブのルアーロック端を開けてください。LFPデバイスの準備が整ったら、麻酔をかけたマウスをプラットフォーム上に配置し、ハブに滅菌生理食塩水を満たします。LFPデバイスのオス側ルアーロックを、ハブのメス側ルアーロック継手に接続します。動物を横向きに寝かせ、正常な呼吸パターンが回復し、かつ感覚が戻る前に振り子を放して、単回パルスの損傷を与えます。パルスの正確な圧力を記録してください。SHA動物には、損傷を誘発するための実際の流体パルスを除き、すべて同様の手順を行います。動物を仰向けに置き、正位反射時間をモニターします。動物が正位に戻った後、再び短時間麻酔をかけます。頭蓋骨からセメントとハブを取り除きます。硬膜のヘルニアがあるかを確認し、その後、VetBond組織接着剤で創傷を閉鎖します。ハブに閉塞がないかを目視で点検します。動物が歩行可能になるまで保温ケージに入れ、その後、ホームケージに戻します。LFP後の行動テストを用いて、認知能および運動能の両方の結果を評価することができます。モリス水迷路は、試験室内の視覚的手がかりを用いて、学習および記憶への影響を判定するために使用されます。シャム手術群のマウスは、プラットフォームの場所を特定する効率が向上します。トレーニングを重ねるにつれ、LFP処置群のマウスは、テストの最初の2日間において、シャム群のマウスと比較して隠されたプラットフォームを見つけるまでにより長い時間を要しましたが、3日目にはタスクを習得したように見えました。損傷が記憶保持に及ぼす影響を判定するため、最後のトレーニングセッションの1日後にプローブ試験を実施します。Sham群のマウスは、LFPを処置したマウスと比較して、標的象限に滞在する時間が長い。LFPによって生じた運動機能欠損は、ローターラグテストを用いて評価できる。LFPを処置したマウスは、損傷後1日、7日、および21日において、sham群のマウスよりも平均落下潜時が短い。GFAP（glial fibrillary acidic protein）染色により、損傷領域の皮質全体でグリオシスが増加していることが示された一方、sham群のマウスでは、同部位においてアストロサイト数の増加は見られなかった。同様に、MAC 1染色では、擬似手術を施したマウスと比較して、損傷部位の周囲に多くのマクロファージが存在することが示されます。さらに、LFPを施したマウスでは皮質組織に物理的な損傷が見られることが多いですが、擬似手術のマウスでは見られません。この処置を行う際は、硬膜を損傷させないこと、およびLFPデバイス内に気泡が入っていないことを確認することが重要です。この手法により、神経科学者は、マウスにおいて、損傷前または損傷後のさまざまな薬理学的および遺伝学的操作を評価できるようになります。これにより、外傷性脳損傷に苦しむ患者において、どの分子が神経変性を抑制し、あるいは再生を促進するかが明らかになります。このビデオを視聴することで、開頭術を行い、頭蓋骨にハブを装着し、そのハブを通じて硬膜に水圧パルスを印加することで、げっ歯類モデルにおいて軽度から中等度の外傷性脳損傷を誘導する方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶマウス外傷性脳損傷モデルの横方向流体パーカッション法。開頭術とハブ装着、水圧パルスによる損傷誘導、術後の形態・行動変化評価の手順を解説し、神経科学研究の再現性向上に貢献します。

横方向の流体のパーカッション：マウスにおける外傷性脳損傷のモデル

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