宿主上皮細胞への細菌付着におけるビトロネクチンの役割を研究するためのアッセイ

接着性上皮細胞単層を含むマルチウェルプレートを取ります。培地を無血清培地に置き換えて、血清タンパク質の干渉を防ぎます。インキュベーション後、培地を取り除きます。細胞をバッファーで洗浄します。ビトロネクチンを含む冷やした無血清培地を追加します。低温でインキュベートします。

ビトロネクチンのN末端RGDドメインは上皮細胞表面インテグリン受容体に結合する温度が低いと、ビトロネクチン-インテグリン複合体の細胞内在化が阻害されます。

インテグリン受容体飽和後、培地を除去します。バッファーで洗浄して、細菌のビトロネクチン依存性インテグリン結合に影響を与える可能性のある過剰なビトロネクチンを除去します。

イン

フルエンザ菌f型、またはグラム陰性菌病原体であるHif懸濁液を追加します。インキュベート。

Hif 表面のプロテイン H はビトロネクチンの C 末端に結合し、上皮細胞への Hif の付着とその後の内在化

を促進します。

培地を取り除き、バッファーで洗浄して、結合していないHifを除去します。細胞剥離酵素を使用して細胞を採取します。酵素反応を止めるために血清含有培地を追加します。細胞懸濁液をガラスビーズの入ったガラス管に移します。ボルテックスして細胞を溶解し、内部化して表面に付着した細菌を放出します。

無血清培地でライセートを希釈し、チョコレート寒天プレートにシードします。ヒフがコロニーを形成するためにインキュベートします。コロニーを数えます。

コロニーの数が多いほど、ビトロネクチンの存在下で上皮細胞へのHif接着が強化されていることを示します。

テキストプロトコルに記載されているようにA549上皮細胞を培養します。摂氏37度で細胞を1回洗浄し、トリプシン処理した後、ゲンタマイシン1ミリリットルあたり5マイクログラムを含む完全培地を使用して、細胞懸濁液を1ミリリットルあたり5,000細胞に希釈します。

細菌感染の前に、ウェル内の培地をF12培地に交換し、摂氏37度で一晩インキュベートします。細胞単層を室温で1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。次に、プレートを氷の上に置き、ビトロネクチン1ミリリットルあたり10マイクログラムを含む200マイクロリットルの予冷F12培地を加えます。

プレートを摂氏4度で1時間インキュベートした後、ピペッティングで溶液を廃棄し、室温で1ミリリットルのPBSで細胞層を2回洗浄します。F12培地で100マイクロリットルの成長したてのHif野生型を各ウェルに加えます。プレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。次に、ピペットで培地を吸引し、A549上皮細胞を細胞剥離溶液のウェルあたり50マイクロリットルでPBSで3回洗浄し、続いて摂氏37度で5分間インキュベーションします。

次に、ウェルあたり50マイクロリットルのF12完全培地を加えて酵素反応を停止します。上皮細胞を各ウェルから4つのガラスビーズを含む6ミリリットルのガラス管に移します。室温で2分間ボルテックスして細胞を溶解します。

細胞ライセートを100倍に希釈した後、希釈したサンプル10マイクロリットルをチョコレート寒天プレートにプレートします。摂氏37度で一晩インキュベートした後のコロニーを数えます。