0 閲覧数 • 4:51 分 • July 8th, 2025
子宮頸部子宮粘膜をシャーレに入れます。子宮頸部外粘膜と子宮頸部内粘膜を粘膜下層から分離します。粘膜層を小さな外植片にスライスし、円錐形のチューブに移します。
ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)を外植片チューブに追加します。HIV-1ウイルス粒子は露出した粘膜層に近づき、宿主細胞のCD4受容体とCXCR4共受容体に結合します。
結合すると、ウイルスエンベロープは宿主細胞膜と融合し、ウイルスRNAと逆転写酵素を含むウイルスカプシドを細胞質に放出します。細胞質内では、逆転写酵素がウイルスRNAを相補的DNA(cDNA)に変換します。
cDNAは宿主細胞核に移動し、インテグラーゼはウイルスDNAを宿主ゲノムに組み込みます。ウイルスDNAは、新しいウイルス粒子に集合する新しいウイルスRNAとタンパク質の合成を指示します。これらの粒子は宿主細胞から芽出し、脂質エンベロープを獲得します。
外植片を適切なバッファーですすぎ、結合していないウイルスを除去します。最後に、外植片を適切な培地でマルチウェルプレート内のゼラチンスポンジに置き、インキュベートします。
気液界面は、スポンジ毛細血管を介した酸素曝露と栄養素へのアクセスを最大化し、下流分析のモデル実行可能性を高めます。
シャーレの蓋を切断面として使用して、組織を解剖します。鉗子で組織をそっと持ち、メスと刃で子宮頸部外および/または子宮頸部の粘膜を間質および粘膜下から分離して、粘膜のストリップを取得します。粘膜を幅2ミリメートルのストリップに切ります。粘膜下層をできるだけ取り除いて廃棄し、厚さ2ミリメートルの組織層だけを残します。次に、ストリップを厚さ2ミリメートルのブロックに切ります。
組織外植片を10〜20ミリリットルのCMTを含む新しい100ミリメートルのペトリ皿に移し、解剖を進める際の組織の乾燥を防ぎます。解剖の最後に、プレートを回転させて外植片の分布をランダム化します。滅菌鉗子を使用して、外植片を滅菌された1.5ミリリットルの円錐形チューブに移します。ピペットを使用してチューブ内の培地を取り除きます。
最適な結果を得るには、子宮頸部の外植片は手術後できるだけ早く、理想的には手術当日に処理して感染させる必要があります。あるいは、組織を CMT に 4 度の一晩沈めて保存し、解剖直後に感染させることもできます。
HIV-1製剤を摂氏37度の水浴で解凍します。解凍したら、ウイルスを外植片を含むチューブに移します。チューブをサーモシェーカーに移し、摂氏37度で300RPMで揺らしながら2時間インキュベートします。30〜60分ごとに数回、チューブをそっと反転させます。
その間、6ウェルプレートに、1ウェルあたり3〜4ミリリットルの滅菌リン酸緩衝生理食塩水を充填します。HIV-1とのインキュベーションの最後に、ピペットを使用して、外植片を含むチューブ内のすべてのウイルス製剤を消毒液の入った容器に廃棄します。次に、鉗子とピペットを使用して、外植片をPBSを含む6ウェルプレートに移します。
外植片を室温でPBS中で1分間休ませた後、PBSをウェルに上下に2〜3回静かにピペッティングして洗浄します。次に、ピペットを使用してPBSを消毒液の入った容器に廃棄します。各ウェルに3〜4ミリリットルの新しいPBSを追加します。さらに2回繰り返して、合計3回洗います。組織の乾燥を避けるために、外植片をスポンジに移す直前にPBSを廃棄します。
次に、鉗子を使用して、各ゼラチンスポンジの上にある5〜8個の外植片を12ウェルプレートに移します。プレートをインキュベーターに戻します。