哺乳類系を介したインフルエンザウイルス様粒子の生成技術

ウイルス様粒子 (VLP) はウイルスの構造を模倣しますが、ウイルスの遺伝物質がないため、毒性がありません。VLP は、免疫細胞によって認識される表面結合抗原エピトープを有しており、理想的なワクチン候補となっています。

換えインフルエンザVLPを生成するには、真核生物の発現ベクターを使用します。

2つのベクターには、赤血球凝集素(HA)とノイラミニダーゼ(NA)(インフルエンザウイルスの構造タンパク質)をコードする遺伝子が含まれています。3番目のベクターには、ヒト免疫不全ウイルスのコアタンパク質をコードするgag遺伝子が含まれています。

カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を追加します。正に帯電した脂質ヘッド基は、負に帯電したDNAと相互作用し、ベクターの周囲に二重層を形成し、リポソームトランスフェクション複合体を生成します。

VLP産生に適した培養哺乳類宿主細胞に複合体を添加し、インキュベートします。トランスフェクション複合体は、リポソーム膜がエンドソーム膜と融合してベクターを細胞質に放出するエンドサイトーシスを通じて細胞に侵入します。

ベクターは核に入り、ウイルス遺伝子の発現につながります。小胞体でのHAおよびNA合成により、タンパク質は分泌経路を介して原形質膜に移動します。

コアタンパク質は細胞質で合成され、原形質膜に固定するためにアセンブリ部位に輸送されます。蓄積されたウイルス成分は、宿主細胞からVLPに自己組織化され、芽

ダウンストリーム処理のためにリリースされた VLP を収集します。

トランスフェクション当日、メーカーの推奨に従ってリポソームとDNA溶液を調製します。DNA組成が1:1:2のHA:NA:Gagで、総DNA量がT-150フラスコあたり40マイクログラムでDNA細胞をトランスフェクトします。この手順を繰り返して、合計容量200ミリリットルの9つのT-150フラスコを作成します。

次に、抗生物質を含まない無血清トランスフェクション培地でDNAおよびリポソーム溶液を希釈し、各フラスコの総容量が24ミリリットルになるようにします。フラスコをインキュベーターに戻し、ウイルス様粒子またはVLPの日まで細胞をトランスフェクション培地に維持し、採取します。

上清を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、トランスフェクション後72〜96時間後に細胞から培養物を回収します。細胞を回転させて、細胞の破片をペレット化します。上清を回収し、0.22ミクロンの細孔膜でろ過します。