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炎症を誘発するためにリポ多糖類を腹腔内に注射した麻酔マウスから始めます。
腹部を切開して腹腔を露出させます。生理食塩水で臓器の水分補給を維持します。ローダミン6Gを眼窩後部に注射します。蛍光色素分子は循環に入り、白血球と血小板を標識して視覚化します。
次に、腸間膜血管で回腸のループを外側にします。最適なイメージングのために、予熱した生理食塩水で組織を水分補給してください。蛍光顕微鏡下で、生体内顕微鏡検査のために腸間膜静脈に焦点を合わせます。
リポ多糖類注射は、セレクチンを含む接着分子のアップレギュレーションにより、内皮細胞の活性化を引き起こします。循環血小板は内皮に動員され、そこで特定の接着分子とリガンドの相互作用を介して結合し、接着複合体を形成します。
これらの相互作用により、血小板が活性化され、セロトニンなどの分子を含む顆粒が放出され、白血球の動員が促進されます。
白血球は内皮表面に移動し、活性化された血小板に結合します。さらに、白血球は内皮に沿って転がり、弱い接着相互作用を介して内皮細胞に結合します。ローリング運動は白血球インテグリンを活性化し、白血球-内皮の移行に重要な内皮細胞への強固な接着を実現します。
生体内顕微鏡を使用して、蛍光白血球と血小板を視覚化し、内皮細胞とのリアルタイムの相互作用を決定します。
生体内イメージングの4時間前に、16〜20グラムの4〜6週間齢の雄マウスに1キログラムあたり20ミリグラムのLPS IPを注射して、模擬細菌の炎症反応を誘導します。
このとき、プラスチックチャンバーと腸間膜組織を加湿するために、摂氏37度の水浴で0.9%生理食塩水を予熱します。次に、LPS処理マウスのつま先つまみに対する反応がないことで適切な麻酔深度を確認し、動物の目に軟膏を塗布する。
シェーバーで腹部を脱毛し、70%エタノールを染み込ませたガーゼで抜け毛を取り除きます。次に、小さな湾曲した鉗子とはさみを使用して腹部を開きます。
心窩部血管を特定し、白線領域の腹膜を開いて血管を保護します。予熱した生理食塩水を数滴腹腔に塗布して組織を湿らせ、続いて50マイクロリットルのローダミン6Gを眼窩後注射して循環血球を標識します。次に、マウスを10センチメートルのペトリ皿に入れ、回腸のループを外側に出し、予熱した生理食塩水を隔分で投与して組織を湿らせます。
生体内顕微鏡検査で炎症反応を可視化するには、マウスを顕微鏡の下に置き、直径200〜300マイクロメートルの腸間膜静脈を視野に持ってきます。
適切な顕微鏡ソフトウェアを使用して、マウスごとに4つの異なる静脈で血球と内皮の相互作用を1分間記録します。次に、細胞間応答を解析するために、安定した個体間の血流状態を確認します。
転がる白血球の数を定量化するには、静脈に垂直線を描き、1分間にこの線を横切るすべての白血球を手動でカウントします。転がり速度を決定するには、静脈に50マイクロメートル離れた2本の垂直線を描き、内皮上を安定して転がりながら、1本の白血球が線の間を横切るのにかかる時間を測定します。
白血球の接着を測定するには、静脈に200 x 200マイクロメートルの正方形を描きます。次に、正方形内で目に見える動きを示さないしっかりと付着した白血球を30秒間手動でカウントします。最後に、血小板と白血球の相互作用を定量化するには、1つの白血球に結合した血小板の数を手動でカウントします。