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ガレリア・メロネラ(オオワックスガ)の幼虫を注射台に置き、腹側を露出させます。
生物発光を生成するために遺伝子組み換えされた生きた細菌ワクチン株であるウシ菌BCGルクスの懸濁液を含むマイクロシリンジを取ります。最後の前脚または腹部付属器に懸濁液を注入し、細菌を血リンパに放出し、体腔内の循環液を排出します。
幼虫を管理された環境に移し、インキュベートします。細菌は血リンパを豊富な栄養源として利用し、増殖します。
血球(血リンパ内の無脊椎動物の免疫細胞)は細菌の周囲に集まり、肉芽腫のような構造を形成して感染の拡大を防ぎます。血球はプロフェノロキシダーゼを放出し、プロテオロキシダーゼはタンパク質分解切断を受けてフェノロキシダーゼを形成します。
フェノロキシダーゼはメラニンを合成し、感染部位の細菌を隔離します。メラニン色素の沈着は全身のメラニン化を引き起こし、幼虫の色を暗くします。
血球は細菌をファゴソームに飲み込みます。ファゴソームはリソソームと融合して溶解酵素を獲得し、細菌の分解を引き起こします。細菌のサブセットは食性リソソーム分解を回避し、血球に存在し、持続的な感染につながる可能性があります。
細菌の生物発光を定義された間隔で測定します。生物発光の最初の低下は効果的な抗菌反応を示し、値の頭打ちは持続的な感染を示します。
購入した齢幼虫は、到着時に摂氏18度の暗所で維持し、購入後1週間以内に使用してください。均一なクリーム色、適切なサイズと体重、高い運動性、ひっくり返したときに自分自身を正す能力に基づいて、実験用の健康な幼虫を特定して選択します。鈍い端のピンセットを使用して、健康な幼虫を濾紙の層で裏打ちされたシャーレに注意深く数え、使用するまで暗所で室温で保管します。
直径94ミリメートルの円形のろ紙を平らで隆起した面にテープで貼り付けて、注入プラットフォームを準備します。3 容量の 70% エタノールを 25 マイクロリットルのマイクロシリンジに吸引して滅菌し、廃棄し、さらに 3 容量の滅菌 PBST ですすいでください。次に、調製したBCGルクス接種物を再懸濁し、滅菌したマイクロシリンジに10マイクロリットルを吸引します。別のシリンジを使用して、陰性対照のPBSTを吸引します。
10回の注射後、BCGルクス接種物を再懸濁して、均一な細胞懸濁液を確保します。ピンセットを使用して幼虫を1匹拾い上げ、注射プラットフォームに置きます。プラットフォームの上で、幼虫を仰向けにひっくり返し、ピンセットで頭と尾を固定して固定します。幼虫の頭からカウントダウンする最後の左前脚を見つけ、針の先端を水平面に対して10〜20度の角度で5〜6 mmの深さに慎重に挿入します。注射器から接種物を注入します。
感染するたびに、感染した幼虫をろ紙の層で裏打ちされたペトリ皿に移します。1つの94ミリメートルのペトリ皿は、最大30匹の幼虫を収容できます。ペトリ皿を、摂氏37度、二酸化炭素5度のインキュベーター内の通気孔のある暗い箱に保管します。
24時間ごとに幼虫の生存を監視します。幼虫は、接触に反応して動かない場合、死亡したと見なされます。生存を記録し、Mantel-Cox 検定で統計的有意性を評価します。