昆虫幼虫におけるルシフェラーゼ発現細菌の生体内負荷の測定

in vivo細菌負荷を測定するには、カルメットゲラン菌(BCG lux)に事前に感染した滅菌昆虫幼虫から始めます。 BCG lux は、生物発光産生酵素であるルシフェラーゼを発現する遺伝子組み換えウシ菌 BCG 株です。

昆虫の幼虫を鋼球で緩衝液を含む溶解マトリックスチューブに移します。ホモジナイザーを使用して、幼虫を均質化し、細菌を含む細胞内成分を緩衝液に放出します。

チューブを遠心分離してホモジネートを回収し、ルミノメーターチューブに移します。

マトリックスチューブを界面活性剤を含むバッファーで洗浄して、細胞断片を可溶化し、残留細菌を放出します。

同じルミノメーターチューブ内の画分を組み合わせ、ルシフェラーゼ基質を加えます。基質は細菌に入り、ルシフェラーゼ酵素と相互作用し、生物発光を引き起こします。チューブをルミノメーターにロードし、生物発光を測定します。

ルミノメーターは、放出された光の強度を測定し、昆虫幼虫におけるBCGの生体内負荷を示す相対光単位(RLU

)を計算します。

希釈したホモジネート懸濁液をピペラシリン含有寒天プレートに広げ、インキュベートしてBCGを別個のコロニーとして選択的に増殖させます。プレート上のコロニーは、コロニー形成ユニット(CFU)を表します。RLUとCFUの比率は、生物発光と細菌の生存率を相関させます。

24時間ごとに、感染した幼虫5匹をランダムに選択し、70%エタノールに浸した綿棒を使用して幼虫の表面を優しく滅菌します。幼虫を、800マイクロリットルの滅菌PBSを含む2ミリリットルの溶解マトリックスチューブに個別に入れます。次に、ホモジナイザーを使用して、幼虫を毎秒6メートルで60秒間均質化します。

溶解チューブを3,500倍gで5秒間遠心分離してホモジネートを蓋から取り出し、ホモジネートを5本の滅菌ルミノメーターチューブに個別に慎重にデカントします。100マイクロリットルのホモジネートを滅菌1.5ミリリットルの反応チューブに予約します。溶解マトリックスチューブを1ミリリットルのPBSTで洗浄して残りのホモジネートを回収し、対応するルミノメーターチューブにピペットで入れます。

ルミノメーターチューブをボルテックスし、ルミノメーターでホモジネートの生物発光を測定します。次に、PBSTを使用して、24ウェル培養プレートで予約された100マイクロリットルのホモジネートの10倍の連続希釈液を調製します。10マイクロリットルの希釈液を各Middlebrook 7H11寒天プレートにピペットでかけ、滅菌プレートスプレッダーを使用して広げます。摂氏37度で2週間インキュベートします。

その後、コロニー形成ユニットを数えます。