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酸素と麻酔ガスが連続的に流れている呼吸ユニットに取り付けられた滅菌手術用パッドに麻酔をかけたマウスを置きます。
フィルターを使用して、注射器に滅菌空気を入れます。注射器に針を取り付け、滅菌した空気をマウスの背面に皮下注入して、組織層内にエアポーチを作成します。回復するまでマウスを監視します。
マウスを再麻酔し、リポ多糖類、LPSをエアポーチに投与します。LPSは、組織に常在するマクロファージおよび樹状細胞上のToll様受容体4、TLR-4に結合し、それらを活性化します。
活性化された細胞は、サイトカインやケモカインなどのさまざまな炎症メディエーターを放出し、好中球やその他の免疫細胞を引き付けます。これらのメディエーターはまた、近くの血管の血管透過性を高め、免疫細胞や可溶性因子が血流から空気袋に入ることを可能にします。
液体がポーチ内に蓄積すると、炎症細胞とさまざまな生理活性分子からなる滲出液が形成されます。
マウスを安楽死させ、適切な洗浄バッファーをエアポーチに注入します。炎症性滲出液を微量遠心チューブと遠心分離機に集めます。上清を廃棄し、細胞を洗浄バッファーに再懸濁します。
炎症性滲出液を分析して好中球比を定量化し、それらの浸潤の程度を決定します。
0日目にマウスを麻酔した後、5ミリリットルの注射器に取り付けた0.22ミクロンのフィルターを使用して、3ミリリットルの滅菌空気を取得します。麻酔をかけたマウスの背中の皮膚をピンセットで持ち上げ、26ゲージ×3/8インチの針を皮下に使用して、滅菌空気を3ミリリットル
注入します。治療後、マウスを呼吸ユニットから取り出し、よく設定されたケージに入れます。マウスを監視して、動き始めるまで生きていることを確認します。3日目に、エアポーチを維持するために、以前に確立されたエアポケットにさらに3ミリリットルの滅菌空気を注入します。
6日目に、エアポーチにさまざまな治療法を注入します。陰性対照として 1 ミリリットルの PBS を注射し、ポジティブ コントロールとして 1 ミリリットルの LPS あたり 1 マイクログラムを注射して局所炎症を誘発します。6時間後、マウスを犠牲にします。
各エアポーチに対して、1ミリリットルの洗浄バッファーを注入してエアポーチを洗浄し、炎症性滲出液を15ミリリットルの遠心分離管に集めます。次に、エアポーチを2ミリリットルの洗浄バッファーで2回洗浄し、炎症性滲出液を同じ遠心分離管に集めます。
室温で100 x gで10分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。自動血液分析装置を使用して、細胞をカウントして好中球比を定量化します。