フローサイトメトリーを用いた尿路病原性大腸菌感染マウス膀胱組織における免疫細胞浸潤の定量化

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尿路病原性大腸菌に感染したマウス膀胱組織における免疫細胞浸潤を定量化するには、みじん切りにした組織をコラゲナーゼとデオキシリボヌクレアーゼを含む消化バッファーに入れます。

定期的に振とうして組織を破壊しながらインキュベートします。

コラゲナーゼは組織の細胞外マトリックスを消化し、細胞を放出します。デオキシリボヌクレアーゼは、干渉する遊離DNAを分解します。

インキュベーション後、キレート剤とウシ胎児血清を含むバッファーを加えて、消化酵素を不活性化します。

消化した混合物をストレーナーに通して組織の破片と結合組織を除去し、単一細胞懸濁液を得る。

細胞

を遠心分離し、Fc遮断抗体を含むバッファーに再懸濁します。これらの抗体は免疫細胞Fc受容体に結合して、非特異的抗体の結合を防ぎます。

免疫細胞の膜貫通型CD45タンパク質に結合する蛍光色素タグ付き抗CD45抗体を追加します。

心分離し、再懸濁した細胞を細胞ストレーナーに通し、細胞凝集体を除去します。

フローサイトメーターを使用して、免疫細胞上の蛍光色素結合抗体からの蛍光シグナルを測定し、膀胱内の免疫細胞浸潤を定量

化します。

膀胱組織でフローサイトメトリーを実行するには、示されているように膀胱を分離した後、はさみを使用して組織をよくみじん切りにします。消化バッファーを含むチューブごとに1つのミンチブラダーを追加し、次にチューブを振って消化バッファーでミンチした組織を洗浄し、すべてのブラダーが解剖されてみじん切りになるまで氷の上に置きます。みじん切りにした膀胱を摂氏37度で60〜75分間インキュベートし、15分ごとに手で5秒間激しく振とうします。

ティッシュが濡れたティッシュペーパーに似たガラス状の透明な外観になると、消化は完了です。2〜3ミリリットルの氷冷フローサイトメトリーバッファーを加えて消化酵素を不活性化し、穏やかに混合します。次に、チューブを氷の上に置きます。

単一細胞懸濁液を確保し、結合組織を除去するには、チューブの内容物を15ミリリットルの円錐形チューブに配置された100マイクロメートルのフィルターに通します。次に、シリンジプランジャーの端で、残りの組織をフィルターにそっと押し込みます。フィルターをさらに2ミリリットルのフローサイトメトリーバッファーで洗浄し、サンプルを氷上に保管します。次に、サンプルを摂氏4度で200回gで7分間遠心分離して洗浄します。

レットを1ミリリットルあたり5マイクログラムに希釈したFcブロックを含む100マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁し、96ウェルの丸底プレートに移します。10〜15分後、各サンプルに100マイクロリットルの目的の抗体カクテルを加えます。次に、光から保護された氷上でサンプルを30〜45分間インキュベートします。サンプルを摂氏4度で200回gで7分間遠心分離して洗浄します。

最後に、細胞ペレットを200マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターで取得する直前に、サンプルを5ミリリットルのポリスチレンチューブ上の40マイクロメートルの細胞ストレーナーに通します。

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最終更新:1 8月 2026