生体外臓器培養における細菌感染モデルを確立する技術

細胞外マトリックス(ECM)で増殖したヒト胎盤器官培養物を取ります。

この培養物は、外側の合胞体(多核栄養膜層)とその下にある細胞栄養膜(CBT)を備えた絨毛様構造を示し、ECMに固定する絨毛外栄養膜(EVT)に分化します。

病原菌であるリステリア菌を紹介します。

インターナリン(細菌の表面タンパク質)はEVT受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して細菌の内在化を促進します。

内在化された細菌は、液胞膜に穴を開ける細孔形成毒素とホスホリパーゼを分泌し、液胞膜の破裂と細胞質への細菌の逃げを媒介します。

逃げた細菌は、アクチン重合のために宿主機構を動員し、宿主細胞膜に向かって推進します。

細菌の病原性因子の分泌は宿主膜に突起形成を誘導する隣接する細胞が細菌を含む突起を飲み込み、感染拡大を引き起こします。

細菌はEVTを介して基礎となるCBTに広がります。

抗生物質を追加して細胞外細菌を除去し、分析用の感染モデルを準備します。

感染を開始する前に、縞模様のある脳心臓注入寒天培地プレートから単一のL.モノサイトゲネスコロニーを3ミリリットルの脳心臓注入ブロスに接種します。細菌の増殖が定常期に達するように、摂氏30度の斜めの位置で培養物を一晩インキュベートします。

翌朝、滅菌ピンセットを使用して、細胞外マトリックスに侵入しなかった浮遊臓器培養片を取り除き、各トランスウェルの底から培地を慎重に吸引します。次に、1ミリリットルの温かいPBSを上下のトランスウェルに2回静かにピペットで入れ、注意深く吸引して各洗浄液を取り除きます。

2回目の洗浄後、臓器培養を妨げないように注意しながら、適切な培地1ミリリットルを上部および下部のトランスウェルにそっとピペットで入れ、培養物をインキュベーターに1時間戻します。

インキュベーションの最後に、トランスウェルの上部にある培地を1ミリリットルの接種物と交換し、プレートを細胞培養インキュベーターに戻して細菌の侵入を促進し、各ウェルのすべての培地を毎日交換します。