マイクロインジェクションによる腸管オルガノイドの寄生虫感染を発症する技術

ヒト腸管オルガノイド培養を取ります。オルガノイドは、中心内腔に面した上皮細胞で構成され、in vivo構造を模倣しています。

寄生虫であるクリプトスポリジウム・パルバムの三日月形のスポロゾイト(感染型)を含むマイクロインジェクターを取ります。

オ

ルガノイド内腔にスポロゾイトを注入します。

寄生虫レクチンは上皮細胞上の特定の炭水化物に結合し、寄生液胞への侵入を促進します。

内面化された寄生虫は栄養型(摂食段階)に変化し、栄養素を獲得し、無性生殖を経て、メロゾイトを含むI型メロント(侵襲型)を形成します。

放出されたメロゾイトは隣接する上皮細胞に感染し、メロゾイトを含むII型メロントを発達させます。

メロゾイトは隣接する細胞に入り、ミクロガモントまたはマクロガモントのいずれか、つまり男性と女性の生殖段階に分化します。

マイクロガモントは分裂してマイクロ配偶子を形成し、液胞の外に放出されます。

ミクロ配偶子はマクロガモントを受精させ、接合子を生成します。

接合子は分裂を受け、スポロゾイトを含むオーシストを形成します。放出されると、スポロゾイトは感染サイクルを繰り返します。

オルガノイドを採取して感染の進行状況を評価します。

3Dオルガノイドの頂端側に寄生虫をマイクロインジェクションするには、まずマイクロピペットプーラーを使用してガラス注入毛細管を準備します。鉗子を使用して毛細管の先端を直径9〜12マイクロメートルに切断し、オーシストを直接注入することを選択した場合は、スポロゾイトまたはオーシストの流れを容易にし、マイクロローダーチップを使用して各キャピラリーを高速緑色色素標識オーシストまたはスポロゾイト懸濁液で満たします。

次に、最初のスポロゾイト充填キャピラリーをマイクロインジェクターにロードし、5倍の倍率と一定の圧力で倒立顕微鏡を使用して、100〜200ナノリットルの懸濁液を各オルガノイドにマイクロインジェクションします。