イネ葉の真菌感染を確定するための噴霧接種技術

乾燥を防ぐために、湿ったろ紙の上にイネの葉の部分を配置したペトリプレートを取ります。

病原性真菌Magnaporthe griseaの分生子(生殖胞子)の懸濁液を取ります。葉の部分にスプレーし、暗くて湿気の多い条件下でインキュベートします。

水分は分生子に粘液を放出させ、葉の表面への付着を促進します。

分生子は生殖管を伸ばし、その先端はドーム型のアプレッソリウムに分化します。

アプレッソリウム内の溶質濃度が高いと、膨圧が生成され、浸透ペグが形成されます。

ペグの直径が小さいため、膨圧を介した力が小さな葉の領域に集中し、葉細胞への浸透を引き起こします。

ペグは栄養を導き出すために侵襲的な菌糸に分化します。

真菌の増殖のために葉の部分を蛍光灯の下でインキュベートします。

菌糸は感染した細胞内で分岐し、原形質素質を介して隣接する細胞に侵入します。

真菌は毒素を分泌して壊死を誘発し、葉の病変を引き起こします。病変をスコアリングして、感染の重症度を評価します。

滅菌手術用ハサミを使用して、3層のろ紙を8センチメートルの円に切ります。ろ紙の円を100mmの滅菌プラスチックプレートに置きます。濾紙を浸すのに十分な量の蒸留脱イオン水を各皿に加えます。次に、2本の滅菌つまようじを各培養皿に2〜3cm離して置きます。

播種後2週間後、茎の下部を切って稲の葉を集めます。サーモスタットインキュベーターを使用して、M.grisea株を摂氏25度のOTAプレート上で4日間培養します。次に、ピペットを使用して、各プレートに 2 ミリリットルの蒸留脱イオン水を加えます。接種ループを使用して、野生型および変異株から菌糸体を菌糸体破片に掻き取ります。

菌糸体の破片を収集し、新しいOTAプレートに移します。次に、菌糸体の破片をきれいなベンチで乾燥させます。培養菌糸体皿に2ミリリットルの蒸留脱イオン水を加え、滅菌綿棒を使用して分生子をそっとこすります。分生子懸濁液を2層のレンズペーパーでろ過し、懸濁液を新しい50ミリリットルのチューブに移します。次に、チューブを5,000倍gで5分間遠心分離します。

遠

心分離後、上清を除去し、ペレットをトゥイーン20溶液で再懸濁すると、1ミリリットルあたり20,000分生子の濃度が得られます。懸濁液をハンドヘルド噴霧器に注ぎます。次に、約10ミリリットルの分生子懸濁液を生後2週間の稲の葉にスプレーします。対照植物の葉にトゥイーン20溶液をスプレーします。

この後、葉を暗い湿気の多い箱で24時間インキュベートします。次に、葉を蛍光灯の湿ったチャンバーに12時間移します。