ウイルス感染検出のためのin vitro組換えウイルスレポーターシステム

膜

貫通受容体であるタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドまたはNTCP(膜貫通受容体)を発現するように遺伝子組み換えされたヒト肝がん細胞培養物を取り上げます。

組

換えB型肝炎ウイルス(HBV)を追加します。ウイルスは、表面タンパク質を含む外側のエンベロープと、ゲノムを囲む内側のヌクレオカプシドで構成されています。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の挿入は、ウイルスの生殖能力を阻害します。

ウイルスエンベロープタンパク質は宿主細胞のNTCP受容体に結合

する

NTCP は上皮成長因子受容体である EGFR と相互作用し、オリゴマー化して、EGFR を介したウイルスのエンドサイトーシスを誘導します。

ウイルスエンベロープはエンドソーム膜と融合してヌクレオカプシドを放出し、核孔複合体で分解されます。

ウイルスゲノムは核に入り、ルシフェラーゼを含むウイルスタンパク質をコードする共有結合的に閉じた環状DNAまたはcccDNA(安定したテンプレート)に変換されます。

所定の間隔で、細胞を回収し、溶解して細胞内ルシフェラーゼを放出します。

レポーター基板を導入します。ルシフェラーゼは基質を酸化し、シグナルを生成します。

感染後のルシフェラーゼ活性の増加は、ウイルスゲノムの継続的な発現を示しています。

HBV感染に感受性のあるタウロコール酸ナトリウム、共輸送ポリペプチド、またはNTCPを安定的に発現するHepG2細胞をプレートし、摂氏37度、CO2%5%でインキュベートします。

感染の1日前に、約5 x 10⁴ HepG2 / NTCP細胞を0.1ミリリットルの培地中の96ウェルコラーゲンコーティングプレートのウェルにプレートします。組換えHPVを摂氏37度のウォーターバスで、バイアルに少量の氷が残るまで解凍します。

78マイクロリットルの新鮮な培地、2マイクロリットルのDMSO、10マイクロリットルの40%PEG8000 1X PBS、および10マイクロリットルの組換えHPVを組み合わせて、感染用の培地を調製します。100マイクロリットルの組換えHBV溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。

感染の1日後、300マイクロリットルのPBSを使用して細胞を3回洗浄し、ウイルス画分から汚染されたレポータータンパク質を除去します。2%DMSOを含む200マイクロリットルの培地を感染細胞に加え、1週間以内にインキュベートします。

HBV感染の分析を行うには、感染の1週間後にPBSを使用して感染細胞を3回洗浄します。50マイクロリットルの溶解バッファーを感染した細胞に加えます。培養プレートを5分間揺らし、次に2000倍gで5分間遠心分離します。50マイクロリットルのレポーター基質をルミノメータープレートに加え、次に20マイクロリットルの細胞ライセートをプレートに加え、短時間振とうして混合します。最後に、プレートをルミノメーターに入れ、読み取りを開始します。