哺乳類細胞からの組換え抗体の作製と精製

重鎖抗体遺伝子と軽鎖抗体遺伝子の別々のベクターを含むチューブから始めます。

トランスフェクション試薬を加えて、ベクターと複合体を形成します。

この混合物を哺乳類宿主細胞に移し、内在化のためにインキュベートします。

凝

集防止剤を添加して、トランスフェクトされた細胞の均一な分布を促進し、細胞の回復と増殖を改善します。

汚染を防ぐために、抗菌抗真菌溶液を追加します。

宿主細胞内では、ベクターは宿主ゲノムに組み込まれます。

遺伝子転写後、個々のmRNAは核を出て翻訳を受けて初期の抗体鎖を形成します。

初期の鎖を適切に折りたたんで変更すると、重鎖と軽鎖が得られます。

これらの鎖が結合して完全に機能する抗体を形成し、細胞外培地に放出されます。

培地を収穫し、遠心分離します。上清をろ過します。

濾液を精製カラムに通し、抗体の選択的結合を可能にします。

溶出バッファーを使用して、精製した抗体を溶出します。

200ミリリットルの培地でCHO細胞を長い三角フラスコに増殖させます。5ミリリットルのCHOフリースタイル培地を50マイクログラムの可変重クローンDNAおよび75マイクログラムの可変軽クローンDNAを15ミリリットルのチューブに入れて混ぜ合わせます。次に、チューブをボルテックスします。混合物を室温で5分間放置します。750マイクロリットルの1ミリグラムのポリエチレンアミンストックをDNA溶液に加え、30秒間積極的にボルテックスします。

混合物を室温でさらに5分間放置します。フラスコを手動で振とうながら、混合物全体をCHOセルに加えます。すぐに細胞を摂氏37度でインキュベートし、130RPMで振とうします。

翌日、2ミリリットルの100倍の凝集防止剤と2ミリリットルの100倍抗菌抗真菌溶液を細胞に加えます。フラスコを摂氏32〜34度で130RPMで振とうしながらインキュベートします。細胞を10〜11日間培養し続け、5日ごとに10ミリリットルのトリプトンN1飼料と2ミリリットルの100倍グルタミンサプリメントを加えます。細胞生存率が80%以上に保たれることを確認するために、3日ごとに細胞を数えます。10日目または11日目に、培養物を3,000倍g、摂氏4度で40〜60分間遠心分離することにより、抗体精製用の培地を回収します。次に、0.22 マイクロメートルのボトルフィルターで透明な媒体をろ過します。

抗体を精製するには、プロテインAカラムを2カラム容量の結合バッファーで平衡化します。ろ過された培地を毎分1ミリリットルの流速でカラムに通します。次に、カラムを2カラム容量の結合バッファーで洗浄します。5ミリリットルの溶出バッファーを使用して、抗体を500マイクロリットルの画分に溶出します。