JoVE 実験百科事典
免疫学
0 回視聴 • 3:03 分 • July 8th, 2025
インフルエンザウイルスの赤血球凝集素(HA)、球状の頭と茎からなる糖タンパク質を標的とする抗体を連続希釈します。
表面結合HAを発現するトランスフェクト哺乳類細胞に希釈液を加えます。抗体はHA茎領域に結合し、免疫複合体を形成します。
転写因子NFATの制御下でFc受容体を発現し、ルシフェラーゼレポーターをコードする操作T細胞を導入します。
インキュベーション中、HA結合抗体はFc受容体に結合し、HAヘッドはシアル酸に結合してT細胞の活性化を引き起こし、細胞質ゾルカルシウム濃度を増加させます。
この活性化によりシグナル伝達カスケードが開始され、その結果、NFAT の脱リン酸化が起こり、その核転座が引き起こされます。
NFATはゲノム内の応答要素に結合し、ルシフェラーゼの発現を促進します。
細胞透過性の生物発光基質を追加します。ルシフェラーゼは基質を酸化し、シグナルを生成します。
抗体濃度の低下に伴う発光の低下は、HA茎特異的抗体を介したT細胞の活性化を確認します。
目的の特定の抗体が血球凝集素発現細胞を標的とする能力を評価するには、ウイルスに感染した細胞培養物の上清を25マイクロリットルの抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)アッセイ培地に置き換えます。
次に、別の96ウェルプレートで、回路図に従って10マイクログラム/ミリリットルから始めて、バックグラウンドを含め、抗体コントロールなしに注意しながら、3回および新鮮なADCC培地で目的の抗体を4倍に希釈します。
すべての抗体が希釈されたら、希釈した抗体25マイクロリットルを実験細胞プレート内の適切な対応するウェルに移し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。15分後、4番目の修飾エフェクターJurkat細胞に7.5倍10を加え、25マイクロリットルのADCC培地でウェルあたり適切なFc受容体を発現させ、ウェルあたり75マイクロリットルのADCC培地の最終容量を得る。
プレートを細胞培養インキュベーターに6時間戻し、インキュベーションの最後の1時間に摂氏37度のウォーターバスでルシフェラーゼ基質バッファーを解凍します。バッファーの準備ができたら、バックグラウンドコントロールウェルを除くすべてのウェルに75マイクロリットルのルシフェラーゼ基質バッファーを加え、ルミノメーターでプレートを読み取ります。次に、トランスフェクトまたは感染した細胞培養における抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の倍数誘導を計算できます。