中和抗体に対するインフルエンザウイルスエスケープバリアントの作製

野生型と変異株の両方を含むインフルエンザウイルス懸濁液を取ります。

赤血球凝集素(HA)と呼ばれるウイルスエンベロープ糖タンパク質は、宿主細胞表面のシアル酸に結合し、ウイルスの侵入を媒介します。

HAに結合し、シアル酸結合部位をブロックする中和抗体を低濃度で添加します。

抗体の中和を回避するのに役立つHAに変異を持つ変異株は、エスケープ変異体と呼ばれます。

混合物を病原体のない胚化鶏卵に注入し、ウイルスを尿膜液に送達し、インキュベートします。

抗体中和ウイルスは絨毛尿膜の細胞に入ることができません。中和されていない変異ウイルスは細胞に入り、複製し、尿膜液に放出されます。

ウイルス集団を含む尿膜液を採取します。

HA特異的抗体を濃度を下げて導入し、エスケープバリアントを除く他の株を中和します。

鶏の赤血球または赤血球を導入します。中和されていないエスケープバリアントが細胞に結合し、赤血球の凝集を引き起こし、赤血球凝集と呼ばれ、エスケープバリアントの生成を確認します。

HI活性を有する中和抗体は、最初に1回の希釈液あたり100マイクロリットルの体積で1倍のPBSで濃度を増加させて目的の抗体の4つの希釈液を調製することによってさらに分析されます。次に、1ミリリットルあたり100万プラーク形成単位のウイルスストックを400マイクロリットルの容量で1倍のPBSで調製します。

次に、ウイルス1ミリリットルあたり100万プラーク形成単位100マイクロリットルを、各抗体希釈液100マイクロリットルまたはPBSの1倍100マイクロリットルと混合します。サンプルを摂氏37度のインキュベーターで5%の二酸化炭素で1時間インキュベートします。

短時間ボルテックスした後、各混合物200マイクロリットルを特定の病原体のない胚化鶏卵に注入します。次に、二酸化炭素なしで摂氏37度で卵を40〜44時間孵化させます。インキュベーション後、ウイルスに感染した感染した胚卵を摂氏4度で最低6時間置いて犠牲にします。次に、前述のように卵から尿膜液を採取します。

最後に、テキストプロトコルに記載されているようにHIアッセイを実行して、エスケープバリアントを確認します。