哺乳類細胞培養物からの組換えモノクローナル抗体の作製

適切なカチオン性ポリマーと、重鎖抗体遺伝子と軽鎖抗体遺伝子用のプラスミドベクターを分離して、トランスフェクションミックスを調製します。

正に帯電したポリマーは、負に帯電したプラスミドと結合し、複合体を形成します。

このトランスフェクションミックスを、無血清培地中のヒト胚腎細胞培養物を含むマルチウェルプレートに加え、インキュベートします。

複合体はエンドサイトーシスによって細胞に入り、エンドソームの腫れと破裂を引き起こし、細胞質に放出します。

カチオン性ポリマーは核膜に細孔を生成し、ベクターの侵入を促進し、その転写を可能にし、その後重鎖タンパク質と軽鎖タンパク質への翻訳を可能にします。

これらのタンパク質は小胞体に移動し、そこで重鎖タンパク質と軽鎖タンパク質が二量体化され、ジスルフィド結合によって共有結合して抗体を形成します。

抗体は、追加の翻訳後修飾のためにゴルジ装置に移動し、細胞外放出のために小胞にパッケージ化されます。

放出された抗体を含む培地を回収します。抗体生成を継続するために、無血清培地を追加します。

HEK細胞を添加したDMEMで調製し、75平方センチメートルの培養フラスコで75%コンフルエントまで増殖させます。重鎖/軽鎖トランスフェクションごとに、血清を含まない1.75ミリリットルのDMEMとの混合物を調製します。4.5マイクログラムの重鎖ベクター、3マイクログラムの軽鎖ベクター、および50マイクロリットルのポリエチレンイミン溶液を含む。この混合物をHEK細胞のプレートにそっと加え、溶液をプレート上で旋回させます。

プレートを一晩インキュベートしてから、培地を毎日収集し始め、血清を含まない培地に置き換えます。培地には抗体が含まれており、4日間毎日収集できます。