メタロペプチダーゼに対する組換え抗体の作製法

カチオン性脂質ベースのトランスフェクション剤を含むチューブから始めて、組換え発現プラスミドを追加します。

プラスミドは、メタロペプチダーゼを標的とする組換え抗体と緑色蛍光タンパク質またはGFPをコードする遺伝子を1つのプロモーターの下に運び、抗生物質耐性遺伝子は別のプロモーターの下にあります。

正に帯電した脂質は、負に帯電したプラスミドと相互作用し、複合体を形成します。

複合体を哺乳類細胞を含むマルチウェルプレートに移し、プラスミドが細胞質に入るようにします。

プラスミドは核に到達し、抗生物質耐性タンパク質のmRNAと、組換え抗体とGFPをコードするビシストロン性mRNAに転写されます。

これらの mRNA は、組換え抗体、GFP、抗生物質耐性タンパク質の産生につながります。

トランスフェクション後、培地を血清強化培地に交換します。

抗生物質を導入し、抗生物質耐性トランスフェクト細胞が生き残っている間、トランスフェクトされていない細胞を選択的に除去します。

蛍光活性化細胞選別技術を使用して、組換え抗体を発現する緑色の蛍光細胞を収集します。

希

釈したトランスフェクト細胞を無血清培地に播種し、インキュベートしてメタロペプチダーゼに対する組換え抗体を産生します。

0.4ミリモルのベータ-D-1-チオガラクトピラノシドの存在下で、BL21形質転換細菌のpET-28a(+)組換え抗体アミノペプチダーゼを摂氏37度のオービタルシェーカーで10時間増殖させます。ウェルあたり100マイクロリットル0.5 x 10⁵チャイニーズハムスター卵巣細胞を96ウェルプレートに播種し、6%二酸化炭素雰囲気中で摂氏37度で18〜24時間インキュベートします。

細胞が80%から90%のコンフルエンスに達したら、プラスミド中のpIRES2-ZsGreen1組換え抗体アミノペプチダーゼをOpti-MEMで0.1マイクログラム/マイクロリットルの最終濃度に希釈します。5分後、プラスミド中の希釈したpIRES2-ZsGreen1組換え抗体アミノペプチダーゼ50マイクロリットルを、1マイクロリットルのリポフェクタミン2000および49マイクロリットルのOpti-MEMと混合します。

20分間のインキュベーション後、CHO細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの混合物を加えます。トランスフェクション後4〜6時間で、培地を10%FBSを添加したDMEM/F12に交換します。

48時間のインキュベーション後、マイクロリットルあたり400マイクログラムのG418を各ウェルに加えて、安定してトランスフェクションされた細胞を選択します。10%FBSおよび400マイクログラム/マイクロリットルG418を添加したDMEM / F12培地を使用して10日間選択した後、蛍光活性化細胞選別で細胞を