抗体によるFc受容体活性化を研究するためのIn vitro人工活性化アッセイ

ナチュラルキラー(NK)細胞の懸濁液を取ります。

抗CD20モノクローナル抗体を加えてインキュベートします。

CD20抗原を発現する標的がん細胞が存在しない場合、抗体のFc領域はNK細胞表面のFcγRIIIa受容体に結合します。

インキュベーション後、冷やした培地を加えます。遠心分離して、結合していない抗体を除去します。

次に、抗ヒトκ軽鎖抗体を添加します。インキュベート。

これらの二次抗体は、モノクローナル抗体のκ軽鎖に結合します。

抗体架橋は標的抗原結合を模倣し、細胞内シグナル伝達カスケードを引き起こします。

これにより、がん細胞が存在しない状態でNK細胞に人工的な刺激が引き起

こされます。

活性化されたNK細胞は細胞骨格の再構成を受け、細胞傷害性顆粒を放出します。

さらに、細胞はケモカインとサイトカインを産生します。

所望の時間の後、冷やした培地を加えて細胞刺激を停止します。

チューブを遠心分離します。抗体を介したエフェクターNK細胞機能の下流分析のために、上清と細胞ペレットを収集します。

100マイクロリットルの再懸濁ナチュラルキラー細胞を1.5ミリリットルのチューブまたは96ウェルのU底プレートに分注し、細胞を氷の上に置きます。リツキシマブまたはその他の目的の抗体を100マイクログラム/ミリリットルの濃度で調製します。

細胞の各チューブに1マイクロリットルを加えて、1ミリリットルあたり1マイクログラムの最終濃度にし、細胞を氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション中に、抗ヒトカッパ軽鎖抗体の溶液を培地中で50マイクログラム/ミリリットルの濃度で調製します。必要な抗体溶液の量は、細胞サンプルあたり 50 マイクロリットルになります。

抗体溶液をヒートブロックまたはウォーターバスで摂氏37度に温めます。細胞のインキュベーションが完了したら、各チューブに1ミリリットルの氷冷培地を加え、細胞を135倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。1ミリリットルの氷冷培地で細胞を再度洗浄します。最後の洗浄後に上清を吸引し、50マイクロリットルの抗ヒトカッパ軽鎖抗体溶液を加えて細胞を活性化します。細胞サンプルをすぐに摂氏37度のヒートブロックまたはウォーターバスに入れ、分析またはその他の手順に必要な時点までインキュベートします。

複数のサンプルを処理する最良の方法は、37度のウォーターバスでフローティングラックを使用することです。