抗原特異的B細胞からモノクローナル抗体を作製する技術

抗原特異的B細胞からクローニングされた抗体重鎖または抗体軽鎖のいずれかをコードする真核生物の発現ベクターを取り上げます。

負

に帯電したベクターと静電的に相互作用してポリプレックスを形成するカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンを導入します。

哺乳類細胞をポリプレックスとインキュベートし、ポリプレックスは細胞に付着し、エンドサイトーシスを介して内在化されます。得られたエンドソームはリソソームと融合します。

ポリプレックス中のポリマーは小胞の浸透圧膨潤を引き起こし、小胞の破裂とベクターの放出につながります。

放出されたベクターは核に入り、重鎖および軽鎖mRNAに転写され、小胞体上のリボソームを介して翻訳されます。

得られたペプチド鎖は抗体に集合し、ゴルジ体に輸送され、分泌小胞にパッケージ化されます。

分泌小胞と細胞膜が融合すると、抗体は細胞外に放出されます。

下流アッセイのために抗体含有上清を採取します。

トランスフェクションの前日に、10%ウシ胎児血清を添加した200マイクロリットルのDulbecco's Modified Eagle Mediumに15,000個のヒト胚性腎臓細胞を播種し、平底の96ウェルプレートの各ウェルに播種しました。次に、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。直鎖状ポリエチレンイミン誘導体トランスフェクション試薬を用いて細胞を共トランスフェクトする。0.5マイクロリットルのDNAトランスフェクション試薬を10マイクロリットルの150ミリモルの塩化ナトリウムで希釈します。

次に、各可変重鎖および軽鎖発現ベクターを10マイクロリットルの150ミリモル塩化ナトリウムで0.125マイクログラム希釈します。すべての希釈液をそれぞれ10秒間渦巻きます。次に、以前に希釈したDNAトランスフェクション試薬を10マイクロリットルのDNA溶液と混合します。DNAトランスフェクション混合物を15秒間すばやくボルテックスし、室温で15分間インキュベートします。

DNAトランスフェクション混合物を細胞に滴下し、プレートを穏やかに回転させます。トランスフェクションの16時間後に培地を交換し、摂氏37度の無血清培地で細胞を5日間培養します。