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ラット胚海馬を例にとります。
トリプシンを追加します。インキュベートして組織マトリックスの破壊を媒介し、海馬細胞を緩めます。
バッファーで希釈します。トリプシンとの酵素消化を継続するためにインキュベートします。
次に、組織塊を培地を含むチューブに移します。単一細胞への機械的解離のために繰り返しピペットを打つ。
培養プレート内のポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラス上の細胞を播種します。
インキュベート。海馬細胞はコーティングされた表面に付着します。ニューロンはラメラを発達させ、小神経突起を伸ばします。
さらに、神経突起は軸索および樹状突起とともに成長し、ニューロンネットワークを形成します。
成熟ニューロンは、シナプス興奮性受容体、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体、またはNMDARを発現します。
インキュベーション後、カバーガラスを培地で洗浄します。
希釈した自己免疫性脳炎患者血清を追加します。自己抗体はニューロンのNMDARに結合します。
バッファーで洗浄し、細胞を固定します。
NMDAR結合自己抗体に結合する蛍光色素標識二次抗体を追加します。
バッファーで洗浄します。DAPIを含む封入剤の上にカバーガラスを置き、核を染色します。
ニューロンの蛍光シグナルを顕微鏡で観察し、血清中の自己抗体の存在を示します。
海馬を含む50ミリリットルのチューブ内の1ミリリットルの2.5%トリプシンで海馬を酵素的に解離させるために、HBSSでチューブ内の体積を5ミリリットルにした後、チューブを摂氏37度のウォーターバスで15分間インキュベートします。トリプシンをさらに希釈するには、予熱したHBSSを10ミリリットル加え、チューブを摂氏37度に設定したウォーターバスに5分間戻します。
次に、1,000マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、粘液塊として現れる海馬を50ミリリットルのチューブに移し、示されているように、6ミリリットルの予熱されたHBSSで組織を5分間インキュベートします。組織を機械的に解離するには、海馬の塊を底が円錐形の2ミリリットルのチューブに移します。予熱したDMEM培地を1ミリリットル添加した後、1,000マイクロリットルのマイクロピペットで上下に穏やかに吸引してペレットを均質化します。
気泡を作らないように、混合物が半透明になるまで、先端がチューブの円錐形の底に接触するように、事前に引っ張られたガラスピペットで上下吸引を10〜20回繰り返します。細胞を数えてから、交差振と振る動きで3.5センチメートルの皿に均等に分配します。完了したら、皿を5%の二酸化炭素を入れたインキュベーターに入れます。
14日間のin-vitro細胞の蛍光免疫染色では、抗NMDAR抗体を含むサンプルをカバーガラスに加え、摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。1時間後、サンプルを固定溶液としてPBS中の4%ホルムアルデヒドで室温で5分間処理します。次に、サンプルをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、続いて二次抗体ヤギ抗ヒトAlexa Fluor 488を1〜1,000希釈で室温で1時間添加します。次に、サンプルを含むカバーガラスを液体埋入媒体で取り付け、残っている液体を吸引します。