呼吸器合胞体ウイルスに特異的な中和抗体価を測定するためのアッセイ

呼吸器合胞体ウイルスまたはRSV特異的中和抗体を含む連続希釈した熱不活化ヒト血清を服用します。

ウイルス懸濁液を追加します。抗体は希釈依存的にウイルスを中和します。

混合物をヒト上皮細胞単層に導入し、ウイルス吸着のためにインキュベートします。

混合物を捨てます。カルボキシメチルセルロース含有培地を加え、半固体のオーバーレイを形成します。インキュベート。

RSVは宿主細胞機構を利用してウイルスRNAとタンパク質を合成し、その後、個々のビリオンとして集合して芽を出します。

感染した細胞は最終的に死にます。カルボキシメチルセルロースはウイルスの移動を制限し、局所感染と細胞死を引き起こし、プラークを形成します。

オーバーレイを取り外します。

アセトン含有バッファーで細胞を固定します。界面活性剤を含むブロッキングバッファーを導入して、細胞を透過性化し、非特異的抗体相互作用を防ぎます。

ウイルスタンパク質を標的とする一次抗体を追加します。

一次抗体を標的とする蛍光色素結合二次抗体とのオーバーレイ。

ウェルを画像化して、蛍光プラークを定量化します。

RSVの50%を中和する最高の血清希釈液は、中和力価を表します。

A549細胞にRSVを接種する前に、光学顕微鏡で細胞プレートを調べて、A549細胞単層が80%コンフルエントであることを確認します。次に、プレートをそっと反転させて培地を廃棄し、滅菌された吸収性のペーパータオルでプレートを軽く拭き取ります。ろ過された滅菌PBSで洗浄するたびに。

次に、原稿に記載されているプレートテンプレートに従って、ウェルあたり100マイクロリットルのウイルスと血清の混合物をA549細胞プレート上の対応するウェルに加え、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で1時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、ピペットを使用してウェルあたり90マイクロリットルを除去し、1X M 199、1.5%CMC、および2%FCSおよびペニシリン-ストレプトマイシン混合物を含む培地を100マイクロリットル加えます。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で3日間インキュベートします。

アッセイプレートを固定して現像するには、まずRSVに感染したA549細胞プレートをそっと反転させて、M 199、CMC、2%FCS、およびペニシリン-ストレプトマイシン混合物を含む培地を廃棄します。次に、200マイクロリットルの固定バッファーを各ウェルにゆっくりと加えます。プレートを摂氏マイナス20度で20分間インキュベートします。次に、固定バッファーを廃棄し、吸収性ペーパータオルで優しく吸い取ります。

プレートを下向きにして10分間乾燥させます。次に、0.05ポリソルベート-20を含むろ過されたPBSバッファーで、5%ミルクブロッキング溶液を作ります。各ウェルに200マイクロリットルのブロッキング溶液を加え、プレートを室温で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、プレートをそっと反転させて溶液を捨て、吸収性のペーパータオルで吸い取ります。

一次抗体を作るには、ブロッキング溶液で1〜500ヤギX RSV抗体を希釈します。各ウェルに50マイクロリットルを加え、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。ろ過したPBSポリソルベートでプレートを3回洗浄します。

次に、ブロッキング溶液で1〜5,000 AlexaFluor Donkey抗ヤギ免疫グロブリンGを希釈して二次抗体を作成します。各ウェルに50マイクロリットルを加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。ろ過したPBSポリソルベートでプレートを5回洗浄します。

自動スポットリーダーでプラークをカウントするには、まず、未使用の96ウェル培養プレートを使用して、FITCチャネルにカウント設定を入力して機器を校正します。次に、細胞プレートを読み取り、ホイルで包み、摂氏4度で保管します。次に、ウェルの画像に人工的なプラークや破壊された細胞単層がないか確認し、破壊された細胞単層を持つウェルを除外します。