電気化学発光アッセイを用いたヒト膵島自己抗体の検出

1型糖尿病のバイオマーカーである膵島自己抗体を検出するには、ヒト血清サンプルを採取し、干渉成分を阻害するために酢酸を添加します。

インキュベートしてからアルカリ性緩衝液を加えて酸を中和します。

処理した血清を、ビオチン化捕捉抗原とルテニウム結合抗原を含むヒト膵島自己抗原の混合物を含むマルチウェルプレートに、それぞれアッセイに最適な濃度で移します。

陽性サンプル中の膵島自己抗体は、ルテニウム結合抗原をビオチン化捕捉抗原に架橋し、抗原抗体複合体を形成します。

混合物を、ブロッキング剤で前処理され、作業電極と対電極を備えたストレプトアビジンでコーティングされた電気化学発光プレートに移します。

結合したストレプトアビジンとのビオチン化複合体相互作用を可能にするためにインキュベートし、洗浄します。

トリプロピルアミンまたはTPAを含むバッファーを追加します。

電気化学発光装置では、電極間の電圧印加によりルテニウムとTPAの酸化が開始され、TPAラジカルが生成されます。

TPAラジカルはルテニウム錯体を励起し、ルテニウム錯体は基底状態に戻りながら光子を放出します。

陽性サンプルの高い化学発光は、膵島自己抗体の存在を示します。

ヒト膵島自己抗原をビオチンまたはスルホタグと1:5モル比でチューブ内で混合し、両方のタグが光に敏感であるため、チューブをアルミホイルで覆います。次に、チューブを室温で1時間インキュベートします。その間、インキュベーションが進行中である間、スピンカラムを2重リン酸緩衝生理食塩水でプライミングします。

次に、カラムを1,000倍gで毎回2分間遠心分離します。次に、スピンカラム内の自己抗原タグ混合物を1,000倍gで2分間遠心分離します。次に、標識された抗原を分注し、摂氏負80度で保存します。

次に、抗原バッファーのチェッカーボードアッセイに基づくビオチンスルホタグ標識抗原の合理濃度を使用して、96ウェルプレートあたり3ミリリットルの抗原溶液を調製します。

次に、各ウェルに4マイクロリットルの血清を加え、1倍のリン酸緩衝生理食塩水で最終容量を20マイクロリットルに調整します。次に、各ウェルに20マイクロリットルの標識抗原溶液を加え、光を防ぐためにプレートをシーリングホイルで覆います。次に、プレートを室温のシェーカーに2時間移します。

シェーカーが止まったら、プレートを摂氏4度で冷蔵庫に18〜24時間放置します。次に、各サンプルに対して15マイクロリットルの血清と18マイクロリットルの0.5モル酢酸を混合し、室温で45分間インキュベートします。

市松模様アッセイに基づいて、ビオチンスルホタグ標識抗原の合理濃度を使用して抗原溶液を調製します。

次に、新しいPCRプレートの各ウェルに35マイクロリットルの抗原バッファーを分注します。血清混合物のインキュベーションのコーラスが完了する直前に、抗原プレート上の各ウェルの側面に沿って、pH 9で3.8マイクロリットルの1モルトリスバッファーを加えます。

インキュベーションが終了したら、25マイクロリットルの酢酸処理血清を抗原プレートの各ウェルにすばやく移し、溶液を攪拌します。次に、光を避けるためにPCRプレートをシーリングホイルで覆い、室温のシェーカーに2時間置きます。完了したら、プレートを摂氏4度で冷蔵庫に移し、18〜24時間インキュベートします。

ストレプトアビジンプレートを摂氏4度の冷蔵庫から取り出し、プレートを室温にします。ストレプトアビジンプレートが室温に達したら、各ウェルに150マイクロリットルの3%ブロッカーAを加え、PCRプレートをシーリングホイルで覆い、冷蔵庫で一晩インキュベートします。

翌日、ストレプトアビジンプレートを冷蔵庫から取り出し、ウェルから緩衝液を排出します。次に、残りのバッファーを浸すために乾いたペーパータオルの上にプレートを逆さまに置いて乾燥させます。次に、150マイクロリットルの1倍PBSTバッファーを加えて、ウェルを3回連続して洗浄します。

次に、30マイクロリットルの血清抗原をストレプトアビジンプレートの各ウェルにインキュベートし、光を避けるためにプレートをホイルで覆います。次に、プレートを室温のシェーカーに1時間移します。1時間後、血清抗原インキュベートをプレートから廃棄し、150マイクロリットルの1倍PBSTバッファーを加えてウェルを3回洗浄します。洗浄が終了したら、各ウェルに150マイクロリットルの読み取りバッファーを加えて、プレートリーダーで読み取ります。